안녕하세요, 제가 현재 pET28a(+) vector에 Nde1/ HindⅢ enzyme digestion을 통해서 곰팡이 gene을 클로닝하였는데요, 그리구 그후 BL21(DE3) 에 Transformation하였구요. protein이 insoluble하게 발현되는것 같습니다. sonication후 centrifuge하기 전에 sample(soluble+insoluble)과 centri- 후에 상층액(soluble)을 SDS-PAGE gel loading을 해본결과 centri 전 샘플에서 밴드가 아주 진하게 발현이 됨을 확인하고, insoluble로 판단을 하고, N-terminal His-tag으로 Purification을 했습니다.(6M Urea으로 pellet녹여서) purification은 생각보다 깨끗하게 잘 되더라구요, 결과를 보면 protein자체는 발현이 아주 잘되고 있는것 같은데 insoluble하게 발현이 되서 문제가 있습니다. 제가 이 protein으로 activity실험을 하고 싶은데, soluble조건을 찾기가 쉽지 않네요..
Induction조건에서는 저온(25℃)부터 30,37℃까지 그리고 시간도 3,5,o/n으로 해봤는데 모든 조건에서 insoluble로 확인이 됩니다. 또한 실험하다가 보니까 IPTG를 넣어주지 않아도 단백질이 발현이 IPTG넣은 준것과 차이가 없더라구요. 이 부분은 BL21(DE3)의 leaky expression 특징을 통해 이해는 했습니다만 다른 실험하시는분들도 이런 현상이 일어나나 궁금해서요..ㅎㅎ
제가 다른 대안방법으로 생각하고 있는것은 RBS site 바로 뒤에 시작되는 ATG부분부터 제 유전자를 Signal peptide부터 넣어주면 세포밖으로 secreting이 되서 soluble하게 발현될 수 있을까 하는 것입니다. 혹시 이런 방법을 해보신 분들이나 알고계신분들은 팁좀 주셨으면 해용 ㅜㅜ
또 다른 하나는 pGEX vector로 아예 교체하는 일인데, 이렇게 벡터를 바꿔보면 soluble하게 발현될수 있다고는 하는데 이것도 가능성이 있는 일인지...
protein실험을 해본지 얼마안되서 기본적인 지식만 알고있습니다. 혹시 많이 해보신분들은 유용한 팁이나 노하우같은거 있으시면 알려주시면 감사하겠습니다 ㅠㅠ!!