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 전체 > Molecular Biology-RNA > Purification/Isolation
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질문 RNA 분리 및 RT-PCR 시 질문 있습니다^^
알슝이  |  2008.04.22 17:01
저는 Trizol method로 RNA를 뽑았구요,
23S 16S 5S rRNA가 band 상에선 잘보이는 상태입니다.

문제는 RT-PCR인데요

저는 RNA seq.를 plasmid에 transformation 후 induction 유무에 따른
RNA 발현양의 차이를 보고 싶습니다.

그런데 이 RNA가 특정 protein과 강한 interation을 하는 RNA라서요..

RT-PCR을 했을때 induction유무에 따른 발현양 비교에서 거의 차이가 없더라구요..

교수님께서는 혹시 protein interaction으로 trizol및 chloroform 처리시 RNA까지 딸려갔을 수도 있다고 하시는데..
(아니면 아직 RT-PCR 조건을 제대로 못잡았을 수도 있구요..)

혹시 Trizol method 사용시에도 Proteinase 등을 처리할 수 있나요?

아니면 다른 실험법을 통해 실험을 하는 편이 더 좋을까요??


선배님들의 많은 조언 부탁드려요~~
#RNA RT-PCR
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
초보박사  |  2008.04.22    
trizol및 chloroform 을 이용해서 RNA 를 불리 했다면...

센트리퓨즈후에 아마 세개의 층으로 불리가 될 것입니다..

상층의 맑은 층은 RNA 가 있구요...
중간층에 찍꺼기 같이 둥둥 떠 있는 층는 DNA, protein dl 썩여 있습니다..
그리고 하층의 붉은 층은 protein, 등이 존재 하게 됩니다..

상층의 맑은 층은 조심 스럽게 취한후,
100퍼센트 에탄올과 1:1로 썩어 RT 에서.. 10분 두었다가...
센돌이 돌리시면 아마 RNA pellet 을 볼수 있습니다..

페놀이나.. trizol 을 사용하게되면.. 거의 대부분의 단백질은 제거가 되는데요..
상층액을 취하실때 조금 썩였을 가능성이 있습니다...
그래서 RT-PCR이 잘 안될을 수도.. 모르겠습니다..

숩을 취하실때,, 조금 주의 하시고,,

RNA를 cDNA 로 만들실때...RNA 양을 좀 줄여서 만들어 보심이 어떨런지요..
발현에 차이가 없다면,,,
아마도.. templete 양이 많거나.. PCR cycle 이 길어 세츄레이션 되어서 발현의 차이가 안나타 날수도 있습니다....

RNA 양을 최대 1ug 에서 500ng , 100ng 50ng 10ng 이케 시리즈로 농도 다르게 해서.. cDNA 맹근후에... 25 cycle 이하로 PCR 한후... 밴드 확인 하고.. effect 가 있는 거 가지고... Taq man 으로 RT-PCR 함 해보세요..

흠 초보라.. 조언이 되었는지 몰겠네요
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