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레벨5
Daegu*
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16.11.17 12:48
위의 그림에서 보시다 시피 칼슘의 반응은 순간적으로 증가 했다가 서서히 감소합니다. 이는 dye와 칼슘이 점차적으로 분리되는 이유입니다. A23187을 처리 하여도 역시나 마찬가지 입니다. A23187을 처리 하여도 세포 내의 칼슘의 증가는 지속적인 것은 아닌 것이, 칼슘이미징을 해보면 A23187을 처리 후 칼슘을 관찰해 보면 점차적으로 형광의 intensity가 감소하는 것을 볼 수 있습니다.
1시간 incubation 하는 시간은 세포 내로 dye가 들어가서 esterase에 의해 ester 결합으로 되어 있는 AM기가 분리 되고 dye가 안정화 되는 시간을 의미한다고 들었습니다.
그럼 질문 있는데요. media에 있는 calcium 농도도 측정을 해볼려고 하는데요.
AM기가 붙어있는거는 dye가 안정화되어 있지 않기 때문에 cell내로 들어가야지만 활성화가 되는 건가요?? media에 있는 칼슘하고 반응하진 않는 건가요??
- AM 기가 붙어 있는 상태에서는 칼슘과 반응하지 않습니다. 따라서 esterase에 의해 AM기가 dye와 분리 되어야만 칼슘과 반응하게 됩니다. 따라서 media 내에 존재하는 칼슘은 굉장히 고농도로 존재(세포 내 보다 상대적으로)하므로, 별로 의미가 없습니다. Non specific한 esterase에 의한 일부 dye의 분리가 있을 순 있으므로, 보통 칼슘 이미징을 할 때에 media를 제거하는 목적으로 washing을 3번정도 해 주게 됩니다. (HBSS 혹은 PBS로)
그리고, 칼슘은 세포 밖으로 배출 되는 것보다는 세포 내부로 들어간다는 표현이 맞습니다. 왜냐하면 이온의 흐름은 농도구배의존적이기 때문입니다. 세포 외부는 세포 내부에 비해 칼슘의 농도가 굉장히 높습니다. 세포 내부는 상대적으로 칼슘의 농도가 굉장히 저농도 이구요, 왜냐하면 칼슘은 secondary messenger이므로 세포 내부에 칼슘의 농도가 낮은 상태여야지만 외부의 신호에 의해 칼슘이 증가하게 되고 여러 enzyme들이 활성화 되는 것이 항상성을 유지하는데 필수이기 때문입니다.
이건 AM이 결합되지 않은 fluo-3를 구매해야 하는 걸까요?
- 의미 없습니다. 왜냐하면 media의 칼슘의 농도는 만들어질 때 부터 고농도로 만들어 지기 때문입니다.
원래 질문과는 상당히 다른 쪽으로 가시는 것 같습니다. 원래 했던 목표랑 멀어지는 듯하여 실험 목적을 다시 생각해 보시길 바랍니다.
처음에는 A23187을 처리 하여 FACS로 칼슘반응을 확인 하고자 하였잖아요? Fluo3-AM역시 FACS에 사용하기도 합니다. A23187을 꼭 1시간 처리 해야 하는 이유가 있는지요? 만일 그렇더라면 제 생각에는 Fluo3-AM을 1시간 incubation 후 A23187을 1시간 incubation 한 뒤에 세포를 고정 후 FACS를 찍을 것 같습니다만...