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 전체 > Molecular Biology-DNA > Sequencing
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질문 plasmid DNA one-cut 제한효소 처리결과 질문입니다.
나무  | 2016.11.07 02:03
답변있는 질문은 수정/삭제 불가(☞문의)
첨부파일 파일첨부: glp1 결과.png (737 KB)
이미지 첨부파일
안녕하세요.


최근에 다른곳에서 받은  plasmid DNA가 있는데, glycerol에 담겨왔었습니다.
실험에 버퍼에 glycerol이 있는것이 방해가되고 침전이 생기는 것 같아서
isopropanol을 이용한 농축을 하여 다시 DNA를 TE 버퍼에 녹였습니다.

혹여나 DNA에 문제가 생겼을까봐
사이즈 확인 겸, one cut digestion 방식을 이용해
제한효소를 처리하였습니다.

gene은 pb-SP-GLP1인데, 인터넷에서 벡터맵을 찾기어려워
관련 논문에 써있는 제한효소가 kpn1과 Xba1 둘이 있어
실험실에 있는 효소인 xba1을 이용하여 실험하였습니다.

첨부된 사진은 NEB buffer와 BSA를 넣고 세시간, 37도씨 인큐베이션 한 결과입니다.

잡밴드가 줄어들긴했지만 여전히 두줄이 뜨고
사실 사이즈가 4kb정도인줄알았는데, 결과에 의하면 최소 5kb 정도인것 같고
또 이상한것은  one cut을 했음에도 진한밴드가 supercolied line에 뜨는 것입니다.
linear line에 떠야할 밴드역시 10kb...

이 사진의 결과는 제 DNA가 two cut이 된건가요?
위에 떠있는 band가 linear band가 맞다면 제가 가진 DNA가 10kb가 넘는 크기인가요?


 
#DNA
 
#전기영동
 
#제한효소
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리강시  |  2016.11.07   
사진으로 볼때, linear DNA의 크기는 5kb 정도입니다.
정확한 크기는 agarose gel의 농도를 조금 낮게 해서 (0.8% 이하로) 다시 걸어서 확인하세요.
마커, cut, uncut 순서로요.

plasmid가 uncut일때는 여러개의 밴드가 나오지만 cut되면 명확한 (몇개의) 밴드만 나와야 정상입니다. 특히 cut된 밴드의 농도가 높으면 밴드의 윗부분이 마치 왕관의 장식처럼 위로 몽글몽글하게 올라가는 것이 보입니다. 님의 젤 사진엑서도 cut된 DNA 밴드가 uncut과는 확연히 다른 밴드 모양으로 보이죠?
cur된 5kb 근처의 밴드 말고 10kb 정도로 보이는 희미한 밴드는 genomic DNA로 보입니다.
plasmid를 뽑을때 좀 과격하게 뽑으면 genomic DN가 딸려나옵니다. 그것은 제한효소로 잘라도 잘 안없어지거나 전체 lane을 지저분하게 보이게 합니다.

supercoil form plasmid DNA의 크기는 linear DNA와 agarose gel에서 비교할 수 없습니다.
왜냐하면 agarose gel % 에 따라서 linear DNA와 cupercoil plasmid의 이동속도가 다르기 때문입니다. 물론 같은 크기여도 마찬가지 입니다.
사진에서 cut DNA의 크기가 supercoil DNA와 같은 크기처럼보이지만 그 supercoil DNA는 5kb가 아닙니다. 그저 그렇게 보이는 것 뿐이며 agarose gel의 농도가 달라지면 또 다른 크기로 보입니다. 그것은 uncut plasmid는 supercoil DNA 이며 마커는 linear DNA이기 때문에 agarose gel에서 비교가 안되기 때문입니다.
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