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 전체 > Molecular Biology-DNA > Sequencing
조회 1723  스크랩 인쇄하기 주소복사 트위터 공유 페이스북 공유 
질문 시퀀싱과 pcr확인
뒷다리잉잉잉  | 2016.10.25 21:46
오늘 제가 dh5알파 transformation후 미니프렙한것들중 pcr을통해 밴드위치 확인된것들을 정말들어간게맞는지 확인하려고 시퀀싱맡겼는데요.

하나도 밴드가안떠서 중단할지 여부를 저에게묻더라구요.

그래서 좀 말이안되는것같아서 일단 중단해놓긴했는데,
그중하나는 이미 in vitro반응으로 product까지 얻은 plasmid엿거든요.
이런결과가 나오기도하나요..? 그럼 제가 한 반응들은 다 의미가없는건가요.ㅜㅜ

되게 이런 전화오니까 당황스럽습니다.
Pcr이 확인되었어도 거기서 밴드가 뜨지않을수있는지...
왜 무엇이 잘못된것인지 알고싶습니다.

조언 부탁드립니다.
#시퀀싱
 
#pcr
 
#답답
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
 |  2016.10.26    
종종 그런 결과들이 나온곤 합니다.

Tarnsformation이후의 prep에서 추출된느 농도가 현저히 낮거나, 혹은 PCR의 증폭률이 현저히 낮은 경우, 혹은 insert size가 짧은경우는 시퀀싱업체 측에서 종종 그런 결과를 보내오곤합니다.

전기영동이란게 일정 농도이상 되지 않으면 있어도 보이지않는 것이고, 또한, 각각 사용하는 band확인을 위해 사용하는 transiluminater의 UV등 차이로 인해 엇갈린 결과들이 보이곤 합니다.

당황하지마시고, 결정을 하시면되요...정말 님꼐서 전기영동으로 확인했을때 band가 있는 것이 확실하다면 시퀀싱을 될것입니다. 다만, 시퀀스 되어 나오는 피크의 purity가 않좋긴하겠지만 말이죠...

 

대왕개구리강시  |  2016.10.26   
그러니까 어떤 벡터에 유전자를 클로닝하고 나서 DH5a에 넣었다는 말이죠?
그 담에 miniprep해서 플라스미드를 뽑았다.
그런 담에 insert가 제대로 들어갔는지 PCR로 확인했다......
머 이런 스토리죠?

miniprep으로 플라스미드를 뽑았으면 인서트가 안들어간 공벡터와 같이 젤에 걸어보지 않나요?
그래서 공벡터보다 클론의 크기가 좀 크다는 것을 확인 안하나요?

그 다음에 공벡터와 클론을 제한효소로 잘라서 아가로스 젤에 걸어보면 답은 나오는데, 그건 안하나요?
왜 PCR만 고집하죠?
PCR은 cross contamination가능성 때문에 신중히 생각해야 합니다.
PCR은 편한 방법이긴하지만 100% 완벽하지는 않습니다.
제한효소 패턴을 확인하세요.
뒷다리잉잉잉  |  2016.10.29   
아 저는 그냥 pcr이랑 앞에서 언급하신 cut해서 확인하는것중에 이게더편해서 안했었어요..

공벡터랑도 확인해보고, 컷해서 확인하고 다시보내보겠습니다. 답변감사합니다.
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