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 전체 > Molecular Biology-DNA > PCR/RT-PCR/Q-PCR
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질문 pfu pcr 조건
알goldwing  | 2016.09.30 12:42
RT-PCR을 진행하고 있는데... RNA isolation은 잘 된것 같고 rt진행후 바로 pcr돌렸는데요.
pfu로 돌린건 band가 아예 안떳구요 taq으로 돌린건 band가 떳어요 근데 저는 pfu로 band를 확인하고 싶습니다ㅠ
pfu 0.3/primer f+r 0.6/cdna 0.5/dntp 1.5/buffer 2 total 20으로 맞춰주었구요
95도 5min->95도 30sec->60도 30sec->72도 2min->72도 2min->ice 5min으로 진행했고 35cycle 돌렸어요
제가 taq이랑 pfu를 같은 조건에서 진행하기는 했는데.. 다른 분은 pfu도 band를 확인했다고도 해서..
어떤식으로 조건을 다시 잡아야 pfu에서 band를 확인할 수 있을까요??
#RT-PCR
 
#PCR
 
#pfu
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
개구리Daegu*  |  2016.09.30   

실험 목적이 무엇인가요? 클로닝인가요, 아님 유전자 발현양 비교인가요?

Phyto  |  2016.10.01    
모든 PCR조건은 같고 다만 taq과 Pfu만 다른 것이죠? (물론 버퍼도 따라 다르겠지요.)
먼저 크게 영향이 없다고 할지라도 두 polymerase pcr조건은 다를 수 있습니다.
pfu 제품에서 제공하는 protocol을 참조하여 PCR시간 온도 재설정해보세요.
간혹 버퍼가 안좋을수 있으니 새것 꺼내 해보세요. (냉-온을 자주 거친 문제)

윗분 답변에 이어 단순히 밴드만 확인하는 것이면 pfu pcr 필요가 없는데
cloning 하기 위한 것 아니라면 왜 굳이 비싼 pfu 이용해서 밴드를 확인하고 싶으신 것인지.

올챙이MPab  |  2016.10.05   

pfu polymerase protocol 다시 확인해보세요.
저도 보통 검출정도를 요하기때문에 taq만 사용해오다가 요근래 pfu 하나를 써본적이 있는데
extension time을 두배정도 요구하더라구요.
모든게 그런진 정확하게 알진 못하지만 같은조건으로 돌리셨다길래 혹시나 싶어서 답글남깁니다.

goldwing  |  2016.10.15    
클로닝 목적으로 하고 있습니다.. Tm값 잡아서 PCR을 여러번 진행해도... 100~300bp정도는 band가 잘나오는데 1kb만 넘어가면 band가 나오질 않아요 ㅠㅠ TM값은 60도 정도라서 55~60도 사이로 다 돌려보고 extension시간도 늘려보고 했는데도..계속 안잡히네요..
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