어..저같은 경우는 보통 2차는 1:1000으로 진행하고 1차를 1:1000 그다음은 1:500으로 진행해봅니다.
그런경우에도 안나올 경우 1:500, 1:500 으로 해서 진행해보는대..
보통 2차보다는 1차 를 더 조절 하는 경우가 많습니다..
2차같은경우는 1차가 나오지만 흐릿할경우? 그때 조절을 더 많이 합니다..ㅎ
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Phyto
(비회원)
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16.09.22 12:08
1차 1:1,000 2차 1:5,000 정도면 웬만한 항체는 잘 반응합니다.
새로운 항체를 시도하시는 것인데,
1:1,000 나오지 않는다고 농도를 높이려는 시도 자체는 좋지만
그보다 중요한 것은 실험 자체가 작동하는지 확인하기 위한 대조구가 없다는 것입니다.
즉 positive control 입니다. 기존에 잘 작동하는 항체와 단백질로 함께 실험하여
항원에 문제가 없는지, 전기영동이나 membrane transfer에는 문제가 없는지 등의
다른 영향인자들이 해결이 되어야 새로운 항체의 농도 결정을 하실 수 있을 것 같습니다.
현재로는 1차 항체가 문제인지 2차 항체가 문제인지
아니면 아예 단백질이 다 degradation되어서 더이상 검출이 안되는지 모르는 것입니다.
밴드가 안나오는데 1차가 문제인지 2차가 문제인지 어떻게 알 수 있나요? 알지 못합니다.
샘플이 40ul인 것은 그냥 부피인데 단백질이 몇ug 들어간 것인지 알 수도 없구요.
그냥 거의 버퍼만 있다면 아무리 항체가 좋아도 검출할 것이 없잖아요.
아무것도 없이 처음부터 시작해서 셋업하는 실험이라면 이것 저것 다 테스트해봐야 하기 때문에 원인을 찾는데 다소 시간이 걸립니다.
그런 것이 아니라면 잘 되고 있는 시스템을 응용하여 하나씩 찾아가시기 바랍니다.
초보자들은 질문해서 답을 바로 얻기 어렵습니다. 왜냐하면 질문부터 많이 부족하기 때문이지요.
어떤 것부터 질문하고 내가 어떤 질문을 가져야 하는지를 배워가야합니다.
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지나가다..
(비회원)
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16.09.22 18:36
1:1000에서 1:500으로 1차의 antibody의 농도를 높여도 겨우 2배 증가한것입니다.
signal이 아무것도 뜨지 않았는데, 겨우 signal이 2배 강해진다고 뜰까요?
절대 안뜹니다.
그리고, 샘플 40ul 걸었다고하는데, 냉정하게 말하면 실험의 기본을 모르시네요.
샘플의 volume이 중요한게 아니라 실질적인 total protein을 몇 ug을 걸었는지가 중요합니다.
밴드가 안나올때는 정말 심각합니다. 뭐부터 해야 할지 모르거든요.
beta actin같은 control은 잘 떳는지부터 확인을 했어야합니다.
그리고 control이 떳음에도 불구하고 target이 안떳다면, 그때서야 antibody를 바꿔보든지,
protein의 양을 늘리던지, antibody의 농도를 높이던지, ECL의 grade를 높이던지 해야할것입니다.
기본부터 합시다.