안녕하세요 석사를 준비하고 있는 학부4년 학생입니다. Cloning과정 중에서 문제가 발생하여 스트레스를 너무 많이 받고 있습니다. 고수님들의 도움이 절실합니다...
요즘 섬모충을 분리하여 동정하는 실험을 하고 있습니다. sequencing을 하기 위해서 cloning을 하던 도중에 실험이 계속 지체되고 있습니다... 문제는 False white colony 때문인데요
white colony를 취해서 항생제가 첨가된 LB Broth에 12시간 배양 후 Plasmid purification 후에 밴드를 확인해보면 insert가 없습니다...
실험 방법을 보면 이렇습니다.
DNA 추출은 GeneAll사의 SV mini를 사용하였고 추출 이후 Ratio는 >1.7의 DNA를 20ng정도 획득하였습니다.
PCR은 TaKaRa ExTaq을 사용하였습니다. 이때 PCR product의 크기는 1769bp입니다.
PCR product를 2% Agarose gel에서 전기영동을 한 후에 Target band을 Mass로 도려내어 Gel Purification을 실시하였고 이 후에 Promega사의 pGEM T- easy vector에 insert를 삽입하였습니다.
4℃에서 Overnight 후 TaKaRa사의 DH5alpha competent cell에 Transformation을 하였고 Ampicillin이 첨가된 LB agar에 0.1M IPTG 4㎕, X-gal(40mg/ml) 40㎕을 혼합하여 도말한 후 충분히 말리고 Transformant를 도말하였습니다. 16시간 이후 White colony를 selecting하여 위에서 설명한대로 배양을 실시했습니다.
이외에 모든 실험과정은 제조사에서 권장하는 Protocol대로 진행하였습니다.
보충설명을 드리자면 다른 분들의 cloning 사진을 보면 White colony가 많이 있는 것 같은데 제가 실시한 plate에서는 Blue colony가 너무 많고 White colony는 셀수 있을 정도로 적습니다. (대략 50개 정도)
20개의 White colony를 취하여 mini prep후 전기영동을 내려보면 전부다 False던가 어쩌다 1개가 간신히 insert가 삽입되있습니다.
50개를 전부 취해서 mini prep하기엔 너무 힘이 들고 Kit낭비가 장난아닐 것 같습니다. 앞으로 계속해서 이 실험을 해야하는데 할 때마다 이런 식이라면 너무 힘들 것 같습니다.
제대로 insert가 삽입된 White colony를 높은 확률로 획득할 수 있는 방법이 없을까요... 부탁드립니다....