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질문 emsa초보 질문드려요..사진有
촙오  | 2008.03.30 21:30
답변있는 질문은 수정/삭제 불가(☞문의)
첨부파일 파일첨부: 스캔0002-1.jpg (202 KB)
이미지 첨부파일
처음으로 엠사시작하는 초보 석사생입니다;

mitf라는 transcription factor와 m-box라는 promoter사이의 binding을

보려고 하는데요...

사진에서 맨 왼쪽 밴드가 stimuli하지 않은 쪽이구요,

나머지 오른쪽부터 다섯개까지가 stimuli하고 시간대별로 sampling한 것입니다.

예상대로라면 왼쪽밴드가 젤 흐리고 오른쪽부터 진해지는 양상을 보여야하는데

전혀 경향이보이지 않습니다ㅠㅠ

두밴드중에 어떤 밴드가 제가 원하는 밴드인지도 알 수 없구요ㅠㅠ

실험은....

우선 올리고머는 바이오니아에서 ssDNA두개 받아서 100pmole로 녹이고

0.1M KH2PO4랑 2M KCl이랑 DW에 두개 넣고

annealing해서 40pmole/ul로 만들고 1/20으로 희석해서

2pmole/ul로 만들어 사용했습니다.

30mer 짜리구요...



probe는

t4 polynucleotide kinase 10x 1ul
ds DNA oligonucleotide 2pmole/ul 10ul
r-32p ATP 5ul
kinase buffer 10x 2ul
DW 4ul

저렇게 넣고 37도에서 한시간 뒀구요

한시간 후에 0.5M EDTA 1ul랑 TE 89ul넣었습니다.

protein은 핵분획으로 10ug 넣었구요

protein+DW 10ul
5x binding buffer 2.2 ul
prove 1 ul

저렇게 해서 10ul loading 했습니다.

넣기전에 37도에서 20분 두었었고

loading dye는 넣지 않고 빈 well에만 넣었고

pre running 한시간 정도 했습니다....

loading한 comb쪽에 밴드가 두껍게 뜨는것으로보아

내려가지 않은것같기도 하고요....

고수님들의 많은 댓글 기대하겠습니다...

졸업 못하게 생겼어요ㅠㅠ
#emsa
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
뒷다리꾸꾸  |  2008.03.31   
사진이 안보이네요. 저만 그런가요?^^
장님  |  2008.03.31    
저도 사진 안보여요.. 컴퓨터 설정상의 문제인가?? ㅁ_ㅁ
개구리Phil  |  2008.03.31   
마우스 오른쪽 클릭하고 새창에서 열기 하시면 사진은 보이네요^^;;
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