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 전체 > Molecular Biology-DNA > Transformation
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질문 transfection 진행할 plasmid DNA가 괜찮은 상태인지 알아보는 법 알수 있을까요?
실험초보  |  2016.06.18 16:24
답변있는 질문은 수정/삭제 불가(☞문의)

Vector에 insert를 넣은 후에 enzyme cut 하여서 insert와 vector모두 확인 하였습니다.

그 이후에 mini-prep을 하여서 plasmid DNA를 뽑았고,

transfection을 진행하고 있는데, 잘 되지 않습니다.

그래서 plasmid DNA 상태가 괜찮은 것인지 알아보고 싶은데 OD값 측정하는 것 말고

좋은 방법이 있을까요?

그리고 insert에 대한 primer를 제작한 후 PCR을 통하여 plasmid DNA를 증폭시켜서

insert가 증폭되었는지 알아볼 수 있는 방법도 있을까요?

그렇다면 insert에 대한 primer는 어떻게 짜야하는 것인지 알고 싶습니다.


실험 선배님들의 좋은 조언 부탁 드리겠습니다.

감사합니다.

#tranfection
 
#plasmid DNA
 
#primer
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
Mini prep으로 뽑은 것으로는 키트로 뽑았다해도 transfection에 쓰는 경우는 거의 없습니다. Midi prep 이상 최소 0.5ug/ul 상태 이사에서 쓰질않나요? 엔도톡신도 제거해주구요... 단순히 리포터 실험이 아니라면.. 더 정제가 잘된 것을 사용하시는 것이.
일루션한 버퍼가 오염되면 잘 안되는 경우도 있어요.
나노드랍으로 평가도 가능해요
올챙이MSDesigner  |  2016.06.19   

silica membrane이 어느정도? 괜찮은 회사의 제품이라면 mini로 뽑아서 transfection을 진행해도 이상없이 잘 됩니다. DNA를 pure하게 잘 정제하였다는 전제하에..
전기영동 확인해서 super-coiled 형태의 DNA가 genomic, nick, linear form에 비해 월등히 많이 존재하도록 정제했어야 합니다.

저는 midi, maxi는 손이 많이 가고 가성비가 떨어져서, large culture후에 mini로 여러개 나눠서 뽑습니다. transfection, sequencing..등등에 사용해도 전혀 문제 없습니다.

이상의 문제가 없다면,
아마도 문제는 어떤 세포에 어떤 transfection reagent를 사용했느냐, protocol은 어떠했느냐..
정도로 생각해 볼 수 있겠네요.

개구리분자생물학이란  |  2016.06.19   
사용하신 Miniprep에서 Endotoxin이 문제가 되었을수도 있지요 


이런거도 참고해보세요(http://www.zymoresearch.com/downloads/dl/file/id/189/d4036d.pdf)
개구리A'ANE  |  2016.06.20   
답변 주신것들 너무 감사드립니다.

혹시  insert에 대한 primer를 제작한 후 PCR을 통하여 plasmid DNA를 증폭시켜서

insert가 증폭되었는지 알아볼 수 있는 방법은 없는 건가요?
글쓴이  |  2016.06.21    
insert를 PCR product로 떴으면 agarose gel 로딩해봐서 해당 사이즈에 밴드 형성되었는지 확인하면 됩니다.
호이호이  |  2016.06.22    
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