안녕하세요
PCR 하는데 어려움이 있어 질문 드립니다

1. 샘플에서 RNA를 뽑아 (Trizol이용)
RT-PCR premix를 이용하여 PCR을 한번 진행합니다
이때 온도 조건은 45℃, 30min -> 94℃, 5min으로 reverse transcription 후
94℃, 3min -> 94℃, 40sec -> 55℃, 40sec -> 72℃, 40sec -> 72℃, 5min입니다 (cycle은 30)

2. Nested PCR로 일반 PCR premix를 이용하여 PCR을 한번더 진행합니다
이때 온도 조건은
94℃, 3min -> 94℃, 40sec -> 55℃, 40sec -> 72℃, 40sec -> 72℃, 5min입니다 (cycle은 30)

이렇게 진행하는데요 ㅠㅠ
양성 control에서는 band가 1줄로 두껍게 나오는데,
제가 RNA 뽑아서 진행한 sample에서는 2band가 나오고 있습니다

annealing온도를 60℃로 했을 때도 2줄이 나오다가
65℃로 한번 해보았을 때는 아예 band가 안나오더라고요..
( positivie control로 PCR을 여러번 해보았을 때, 2band가 뜬 적은 없었습니다.. )

제가 원하는 것은 1band로 깨끗하게 나오거나, 안나오는 것입니다

혹시 비슷한 경험이 있으셨던 분이나, 조언해주실 방법이 있으시면 알려주세요. 부탁드립니다 ㅠㅠ

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