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 전체 > Molecular Biology-DNA > PCR/RT-PCR/Q-PCR
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질문 PCR에서 2band가 뜹니다 ㅠㅠ
안녕하세요  | 2016.06.02 10:07
답변있는 질문은 수정/삭제 불가(☞문의)
첨부파일 파일첨부: nested PCR.png (181 KB)
이미지 첨부파일

안녕하세요
PCR 하는데 어려움이 있어 질문 드립니다

1. 샘플에서 RNA를 뽑아 (Trizol이용)
RT-PCR premix를 이용하여 PCR을 한번 진행합니다
이때 온도 조건은 45℃, 30min -> 94℃, 5min으로 reverse transcription 후
94℃, 3min -> 94℃, 40sec -> 55℃, 40sec -> 72℃, 40sec -> 72℃, 5min입니다 (cycle은 30)

2. Nested PCR로 일반 PCR premix를 이용하여 PCR을 한번더 진행합니다
이때 온도 조건은
94℃, 3min -> 94℃, 40sec -> 55℃, 40sec -> 72℃, 40sec -> 72℃, 5min입니다 (cycle은 30)

이렇게 진행하는데요 ㅠㅠ
양성 control에서는 band가 1줄로 두껍게 나오는데,
제가 RNA 뽑아서 진행한 sample에서는 2band가 나오고 있습니다

annealing온도를 60℃로 했을 때도 2줄이 나오다가
65℃로 한번 해보았을 때는 아예 band가 안나오더라고요..
( positivie control로 PCR을 여러번 해보았을 때, 2band가 뜬 적은 없었습니다.. )

제가 원하는 것은 1band로 깨끗하게 나오거나, 안나오는 것입니다

혹시 비슷한 경험이 있으셨던 분이나, 조언해주실 방법이 있으시면 알려주세요. 부탁드립니다 ㅠㅠ

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#PCR조건
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
개구리Daegu*  |  2016.06.02   
첨부파일 파일첨부: asd.jpg (37 KB)
이미지 첨부파일

질문자 질문에 답이 이미 나와 있네요,,
단순히 annealing temperature 의 문제로 보입니다. primer의 annealing 온도를 다시 한번 점검 후 PCR 진행하세요, 일반적으로는 Tm 값의 -4로 하라고 하는데요, 하지만 gradient PCR을 통해 최적 조건으로 하는게 더 좋을거 같다는 판단이 듭니다.


그리고 65도와 60도는 분명 큰차이가 있습니다, 그 사이의 온도로 해보시는게 좋을거 같네요,

첨부 사진은 gradient PCR 한 조건인데요, 맨 왼쪽이 65도 이고, 1도씩 감소합니다.
65도부터 62도까지는 1band이구요 61도 부터 2밴드가 보이기 시작합니다.
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