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1. B가 들어있는 cell lysate를 이용할 경우 direct binding인지에 대해서는 결론지을 수 없습니다. 왜냐하면 lysate내에 다른 단백질들도 무수히 많기 때문이지요. direct binding을 확인하기 위해서는 B역시 정제한 단백질로 A와 B만 넣고 binding을 시켜서 보셔야 합니다.
2. Ni-NTA bead는 charge에 의해 붙는 성질이기 때문에 nonspecific이 굉장히 많을 수 있습니다. 더구나 lyaste를 이용하신다면... 깨끗한 결과를 위해 anti-His와 protein G 를 사용하시기 바랍니다. control은 단백질 A를 넣지 않든지, 동일하게 단백질 A를 넣고 IgG로 IP 하시면 됩니다.
3. His-A은 대략 1ug정도 넣고 시작해보시면 될겁니다. binding이 약할경우 더 넣으시고, 강할경우 낮추시면 됩니다.
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레벨1
phaein0411
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16.05.23 16:07
감사합니다~!!
한가지만 더 여쭤볼게요~
IP후에 western으로 결과를 볼 때 A 단백질과 B단백질의 Antibody로 Detection을 하려고 하는데요~
Antibody로 detection을 해서 A와 B에서 밴드가 나온다면, 두 단백질이 direct한 결합을 하고있다고 보기 어려운가요??
direct binding을 확인하기 위해서는 앞서 말씀드린대로
protein A + protein B 만 넣고 binding을 시켜야 합니다. 물론 이 경우에도 antibody+protein G 나 nickel bead로 pulldown을 하셔야겠죠.
protein A는 정제한 단백질이지만 binding 시킬 때 protein B가 들어있는 cell lysate를 넣어 binding 시킬 경우에는 lysate에 존재하는 다른 단백질이 protein A와 B 중간에 끼어서 indirect binding을 유도할 수 있습니다. 그렇기 때문에 WB상에서 확인이 되더라도 direct binding이라고 할 수 없습니다.