SDS buffer로 당연히 떨어집니다.

하지만 해보시면 그냥 bead에 붙는 단백질이 생각보다 훠얼씬 많다는걸 아시게 될 겁니다.. -_-

버퍼 넣고 끓이면 붙은 단백질은 모두 다 나올 것입니다.

그러나 Ni-NTA는 Nonspecific binding 이 꽤 많은 affinity resin 인 관계로 반드시 negative control (단백질 안 붙인것) 을 하시는 것이 좋겠고 (아마 그냥 Cell Lysate 를 걸고 Washing을 많이 해도 상당히 많은 단백질이 붙어나올 것입니다), Protein 은 가능한 적은 volume의 bead 에 saturation 되게 붙이는 것이 좋을 듯 합니다.

6xHis-Ni-NTA 결합은 이온결합이기 때문에 끓이면 당연히 protein이 떨어져 나올겁니다. 하지만 많은 non-specific이 존재하기 때문에, full down assay등에는 잘 이용하지 않는 것이 his 방법입니다.

이런 경우, 차라리 GST fusion protein을 사용하시는 것이 좋지 않을까 하면,
또한 Ni-NTA resin에서 단백질을 모두 떼는 방법은 끓이는 것보다는 EDTA로 Ni ion까지 모두 떨구는 방법이 좋을 듯합니다.

저는 그거 제품으로 나온거 썼던거 같은데요.. 오래돼서 기억은 가물가물 한데
키트로 나온 컬럼 써서 정제 후, 웨스턴 했었어요.

답변 감사합니다.

그냥 Ab 써서 pull down 해야겠네요..

magnetic Ni-NTA bead로 pull down 하는 방법이 있길래 한번 해 볼까 했더니 (SDS-PAGE 상에 Ab band가 없어질테니 유리하겠다고 생각하고) nonspecific binding이 많다면 의미가 없는 것이겠지요..