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14KDa 단백질이면은 많이 작은 단백질은 아니네요
젤 내리는거야 문제가 없겠구
트랜스퍼에서 문제가 있다는 말씀이신가요?
또 트랜스퍼와 단백질 발현에는 상관이 없구...
제가 보기에는 높은 전앞 혹은 긴 트랜스퍼에서 문제가 생기는것 같습니다.
트랜스퍼 기기와 조건을 같이 올려보세요
그래야 어떤 조건인지 알수 있을것 같습니다.
ponceou staining을 했을 때 밑쪽의 단백질이 적게 보인다는 말인가요? 원래 밑으로 가면 발현되는 단백질의 수(종류)가 상대적으로 적어서 잘 안 보이는 편입니다. 하지만 그게 단백질이 없다는 뜻이 아니니 웨스턴을 해보세요.
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Western 10년 고수
(비회원)
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08.03.10 12:01
젤은 15~16%를 사용..Sambrook책을 참고하세요.
높은 %의 젤을 사용시 사이즈가 적은 단백질을 깨끗하게 확인할 수 있겠죠?
따라서...높은 %젤을 사용하여 많이 running을 하세요.그래야 사이즈가 적은 단백질들 간에 잘 separation이 되겠죠...
참고로, 사이즈가 적은 단백질을 젤 상에서 볼땐 상대적으로 사이즈가 큰것보단 흐리게 보인답니다.
한가지 충고...running할때 빨리 할건지 느리게 할건지, 볼트를 기준으로 할건지 암페어를 기분으로 할건지...개인이 테스트를 하세요. 높은 사이즈의 단백질들은 흔히 대충해도 웨스턴 밴드가 께끗이 나오는데 사이즈가 적은 단백질들은 공을 들려야 해요...논문에 실기 위한 좋은 퀄러티를 위하여...
다시 궁금사항이 있으면 다시 글을 남기세요.
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14kDa
(비회원)
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08.03.11 00:17
답변 갑사합니다.
우선, 러닝전압과 타임은 50-60V, 2-3시간 걸리고요,
트랜스퍼는 50V 2시간 합니다.
제가 궁금한건 트랜스퍼까지는 잘 된거 같은데..
워낙 로우사이즈 프로테인을 보는거라서 잘 잡히지가 않는거 같아서요.
그래서 혹시라도 전압 혹은 암페어를 낮춰서 오래동안 러닝을 한다던가..
그런 식의 노하우가 있는지요..
25kDa 이상의 단백질을 보는건 문제가 없는듯 한데, 유독 14kDa (sPLA2) 단백질 보기가 어렵네요.