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 전체 > Molecular Biology-DNA > Gene Cloning
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질문 cloning시 linker 삽입
올챙이초보클로닝  | 2016.05.01 21:20
안녕하세요. 클로닝을 하는데 방법을 잘 모르겠어서 질문드립니다.

현재 2개의 protein을 동시발현하기위해 cloning계획중인데요
2개 protein 사이에 linker를 넣어야 각 protein간에 서로 영향을 덜받는다고 해서 linker를 넣을까하는데, 이거를 어떤식으로 집어넣는것인지 모르겠습니다. ㅠㅠ
protein은 각각 아래와 같이 연결할 계획이었습니다.
 enzyme1-proteinA-enzyme2, enzyme2-proteinB-enzyme3

저 proteinA,B사이에 linker를 넣을건데, 예를들어 GGS를 넣는다고하면, 그냥 GGS의 sequence를 enzyme1-proteinA-GGS-enzyme2 이렇게 넣으면 되는것인가요..?
아니면 처음부터 vector에다가 GGS를 넣어놓고, 그뒤에 insert들을 넣는게 나을까요?

제가 linker를 넣는다는 개념자체를 제대로 이해하고있는건지 모르겠습니다.
설명이 부족해서 잘 전달되었는지는 모르겠으나, 꼭 답변부탁드립니다..
#cloning
 
#linker
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
꽃개구리느림보  |  2016.05.01   
링커가 한 군데만 들어간다면 각각의 유전자에 제한효소 자리를 넣지 말고,
그냥 overlap PCR로 GGS를 삽입해서 둘을 연결하는 것이 간단하지 않을까요?


PCR1 Enzyme site 1 - Gene A - GGS
> f1.1      <-----r1                           
PCR 2                                               GGS - Gene B - Enzyme site 2
     ----> f2                 <---- r2.1


overlap extension & end-to-end PCR
Enzyme site 1 - Gene A - GGS - Gene B - Enzyme site 2
        f1.2  --->                                                                <----- r2.2

각각을 GGS가 붙도록 PCR한 뒤에, 둘을 정제해서 annealing시켜서 신장시키고, 마지막으로 전체를 증폭해내면 됩니다. 
r1과 f2는 GGS에 해당하는 염기서열로 짜면 됩니다. 

f1.1과 f1.2, r1.1과 r1.2는 nest가 되도록 디자인하면 좋습니다. 그냥도 되긴 합니다.


overlap extension PCR로 구글하면 많이 나올 겁니다. 

올챙이초보클로닝  |  2016.05.01   
답변감사합니다.
정말 간단한 방법이네요.
PCR할때, geneA,B을 각각 PCR한 후, 두 pcr products를 동시에 PCR하는 과정에서, f.1.2, r2.2를 쓰라고 써주셨는데, 그냥 f1.1, r2.1로 PCR하면 안되나요??
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