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 전체 > Molecular Biology-DNA > Purification/Isolation
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질문 DNA prep. 중 침전 문제....
DNA추출  | 2016.04.28 17:18
답변있는 질문은 수정/삭제 불가(☞문의)

plasmid DNA 추출 중입니다.

추출 상태: DNA + 0.1M NaCl 이 포함된 TE buffer

이후 Isopropanol 0.7 vol. 첨가 10000g 40min, 70% EtOH 15000g 10min 하여 dry 후

TE buffer에 녹였습니다.

Isopropanol 첨가 전에 농도를 측정하였을땐 10mg이었는데

TE buffer에 녹인 후 다시 측정하니 DNA가 거의 없는 것 같습니다.

isopropanol 첨가 후 원심분리 하였을때도 흰색 pellet이 보이지 않았습니다.

현재 Isopropanol 첨가 + 70% EtOH로 된 sup.이 남아 있습니다.

혹시 이 sup에 100% EtOH를 2~2.5배 넣고 원심분리하면 DNA를 얻을수 있을까요?

아니면 다른 방법이 있으면 추천 부탁 드립니다....

#DNA
 
#DNA 추출
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
개구리식스센스  |  2016.04.28   

다른 것은 차치하더라도 isopropanol을 첨가하였을 때 pellet이 보이지 않았다는 말은
앞선 단계에서 문제가 있었다는 것을 의미합니다.
처음부터 DNA 양이 적은 경우가 아니라면 isopropanol을 첨가하였을 때 pellet이 보이기 마련입니다.
아무래도 cell lysis 과정에 사용한 buffer가 contamination되었거나
cell이 contamination이 되었을 가능성이 높아 보입니다.

또는 TE buffer가 contamination이 되었을 가능성도 배제를 할 수 없습니다.

DNA추출  |  2016.04.28    
답변감사합니다. ㅠ.ㅠ

그런데 마지막에 DNA 농도도 측정하고 전기영동으로 확인 하였을때도 문제가 없었습니다...

100% EtOH로 다시 회생시켜 볼라고 했는데 힘든일인가보네요...ㅠ.ㅠ
대왕개구리강시  |  2016.04.29   
알콜에 ppt 시킬때 침전이 안되는 것은 salt의 부족때문입니다.
보통 DNA 부피의 1/10 의 3M NaAcetate를 넣고 두배의 EtOH이나 0.6 배의 isopropanol을 넣어야 합니다.


만일 isopropanol을 넣고 원심분리한 sup이 있다면 거기에 DNA 부피의 1/10 의 3M NaAcetate나 3M NaCl을 넣으면 됩니다.
개구리정인아빠  |  2016.04.29   
plamsid 를 10mg을 뽑으셨다니 어디에 쓰시려고 그리 많이 뽑으셨나요? 궁금하네...
남아있는 sup에 3M sodium acetate를 (DNA + 0.1M NaCl 이 포함된 TE buffer+ 70 % ethanol) volume의 1/10 volume을 넣고서 2배 Ethanol 넣어서 -20도에 두었다가 원심분리하면 다시 얻을수 있을것으로 보이네요.
꼭 Salt를 첨가해주어야 침전이 됩니다. 
10mg 이면 굉장히 많은 양인데 혹시 잘못쓰신건 아닐런지?
저기에 침전이 안될 양이 아닌거 같은데요...
 
DNA 추출  |  2016.05.03    

답변 감사합니다.
salt 넣어서 다시 해보도록 하겠습니다~

동물 실험용과 공정개발용으로 대량 생산하는 중이라 10mg이상 뽑고 있습니다~^^

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