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레벨4
Vinejung
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16.04.27 13:47
액체 질소로 freeze AND thaw (37C) 3번하면 pLys 균주는 잘 분해됩니다
끓이는 것으로는 무리일까요.. 질소를 쓰는 방법이 최선일까요 질소도 없는데..ㅠㅠ
발현양을 확인만 하는 단계인가요?
대장균을 어느정도까지 배양했는지는 모르겠으나,
1 ml을 스핀다운해서 배지를 제거하고 lysys buffer 40 ul 를 넣고 pipetting해서 풀어줍니다.
40 ul의 2X loading buffer를 넣고 섞은 후, 10분 boiling.
Spin down하지 않고 10-20 ul 를 젤에 loading하면 induction 정도는 확인이 잘 됩니다.
참고로 저는 induction하기 전과 후의 대장균액을 OD 측정해서 같은 수의 대장균이 되도록 harvest 하는 양을 조정합니다.
왜냐하면 IPTG를 넣으면 외부단백질을 대장균이 발현하느라 growth가 느려지기 때문입니다.
이렇게 대장균수를 조정해서 시료를 만들면 induction전 후의 단백질 밴드릐 intensity가 같게 나오고 induction된 밴드만 차이가 나기 때문에 induction수율이 낮아도 확인이 용이합니다.
Induction 후에 대장균을 끓여서 준비했는데 젤에서 밴드가 잘 안보이는 것은 끓인 다음에 spin down 하면 inclusion body를 형성할 경우 induction 된 밴드가 ppt로 제거되서 안보이는 것과, 밴드가 진하게 보이길 기대하면서 대장균을 너무 많이 harvest해서 시료가 너무 지저분해지는 경우 등입니다.