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질문 guide RNA annealing이나 PCR 어떻게 돌리시나요? 도와주세요!
뒷다리통합2년차  | 2016.04.24 10:27
저희 실험실에서 CRISPR/Cas9 system을 도입하려고
setting을 하기 시작했는데 이게 몇달째 계속 실패해서 허덕이고 있습니다..ㅠㅠ

저희가 vector를 구매한건 아니고 다른 교수님 실험실에서 얻어온걸로 진행하고 있는데요..
가장  큰 문제가 이 분들께서 사용하시는 vector에 대한 정보가 없다는 겁니다.
직접 합성하셔서 만든건지 모르겠는데 정확한 vector의 풀네임을 안 가르쳐주셔서요..ㅠㅠ

gRNA가 특징이 Amphicilin resistance이고, size는 3.2kb 입니다.
U6 promoter 다음에 Stuffer라고 700bp정도 되는 쓸모 없는 덩어리가 있고, 그 뒤에
extRNA 전사하는 promoter? 같은게 달려 있습니다. 저희는 이 stuffer를 통째로 날리고
거기다 28bp 짜리 oligo를 집어 넣으려고 하고 있습니다.

1.gRNA를 Bsa1으로 3ug정도 잘라내서 gel extraction합니다.

2.이 다음이 문제인데요...oligo들 annealing 할떄 보통 어떻게 하시나요?
저희는 처음에 setting 중이라 잘 모르겠는데요..

A) 지금은 oligos를 의뢰해서 주문한걸 100pmole짜리를 5ul씩 5', 3' 총 10ul를
NEB T4 Polynucleotide kinase(PNK) 거기 쓰여진 protocol대로 처음에는
50ul씩 하다가..이게 너무 희석되는거같아서 20ul으로 줄여서 37도에 1시간 반응 후
95도의 팔팔 끓는 물 2L에 e-tube 밀봉한 후에 mineral oil 섞어서 증발을 방지해준 상태로
5min정도만 95도에 냅둔 후, 교반기 히터를 꺼버리고 28도까지 떨어질때까지
몇 시간이고 방치합니다. (최소 5시간 이상 걸리더라구요)

B) 혹은 oligos만 섞어준걸 그 상태에서 위의 과정처럼 팔팔 끓는 물에 담근후 마찬가지로
식혀주고, T4 PNK 처리합니다.

*여기서 얘네들이 PNK 됬는지 안됬는지 어떻게 알죠..ㅠㅠ?
그리고 PNK 처리안해도 잘 들어간단 얘기도 있긴하던데..모르겠습니다..ㅠㅠ

3. ligation 해볼려구.... gel 내려서 확인하면 gRNA vector 1ul 넣은게 20ng
수준의 band라면 oligos 5ul 넣은 건 상당히 blurry하게 퍼져있습니다.

같이 세팅하는 선배말씀으로는 oligo 양이 너무 작아서 그런건 같다는데 양이 적었으면
아얘 밴드에서 보이지도 않았지.. 이게blurry하게 퍼지지않을거 같아서요..
그냥 vector 1ul :  oligos 10ul로 섞어버리는데..이거는 명백히 잘못된거 같구요..

그저께 다른 실험실에서 배워오라고 시켜서서 갔는데 
소극적으로 protocol을 알려주셔서 그 분들은 oligos를 1:200으로 희석시킨후
걔를 1ul 따서! 넣는다더라구요. 그렇게는 안해봤습니다(...)

아무튼 걔네를 RT에다가 ligation O/N 해둔 후에 , CaCl2 E.coli Competent cell에다
transformation 하고 1시간 LB에 배양해준 후에 Amphicilin plate에 도말 해서 또 O/N 해둡니다..

그럼 다음날.. 콜로니가 아얘 안뜨거나, 1~3개정도 뜹니다.
여기서 또 문제가 발생한게..

3. Colony PCR을 진행합니다. Primer는 프로그램으로 짜서
gRNA Plasmid의 U6 promoter 5'이랑 ..이 plasmid가 합성한건지 대충 짜서 만든건지 모르겠지만
reverse쪽을 읽어주는 정보가 전혀 안  적혀있어서;; 따로 extRNA쪽 3'을 긁어서 만들었습니다.

그리고 PCR을 굴리면 PCR 자체가 안됩니다.
제가 primer를 짤때, extRNA랑 U6promoter랑 이게 stuffer가 날아가면
30bp밖에 표시못하니까 한 150bp 표시할수 있도록 만들어놨는데.

웃긴건 stuffer가 멀쩡히 들어간 gRNA는 PCR하면 3.2kb에서 잘 뜹니다.
근데 자르고 만든놈들은 뭘 해도 안뜹니다... 뭐가 문제인지 모르겠습니다
primer를 다시 짜야할지.. 아니면 oligo 3'이랑 u6 promoter를 pcr돌리는게 나을지..

CRISRP 하시는 분들 꼭 좀 도와주세요


 

#gRNA
 
#CRISPR
 
#Cas9
답변하기
답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
어휴  |  2016.04.25    
Oligo annealing 하는 방법만 간단히, 제가 하는 방법으로 알려드리겠습니다.

먼저 PNK는 올리고 합성시 P을 레이블 하시면 할 필요가 없고, 이렇게 하지 않았다면 해야합니다.

Oligo annealing은 PCR machine을 이용하면 편리합니다.

PCR tube에 올리고 top strand (20 nM, pmole) 1~2 ul + bottom  top strand (20 nM, pmole) 1~2 ul + PNK buffer + 10 mM ATP (1 ul) + PNK (1 ul) + ddH2O 이렇게 해서 20~30 ul 만들고
37도에서 30분 반응 후 95도에서 3분 후  PCR machine의 전원을 끄고 뚜껑을 열어 1시간 정도
방치하시면 됩니다. 보관은 -20도 녹일때는 ice에서 하시면 됩니다.

이것 1~2 ul를 적정량의 벡터와 ligation 하면 됩니다.
인산화가 된지의 여부를 확인할 방법은 없고 20~30 bp짜리를 아가로스 겔에 걸어봐야
뭐가 보이겠습니까? 꼭 확인하고 싶으시면 아크릴 아마이드 겔에 전기영동 하시는게...
후엥  |  2016.04.26    
답변 감사드립니다 .ㅠㅠ...
대부분 다들 PNK 먼저 돌리시고 그 상태에서 annealing 하시네요 ㅠㅠ

selection 하실때는 어떻게 하시나요?

이게 도통 PCR이 안되다보니 700bp를 왕창 잘라버려서
primer가 뭔가 조건이 너무 바껴서 안돌아가는건지 도저히 모르겠습니다..

1% agarose gel로 만들고 Sample buffer loading dye 빠지기 전에 보면
보이기는 합니다.. 좀 블러리하게 보여서 그렇지..ㅠㅠ
어휴  |  2016.04.28    

extRNA,  stuffer가 뭔가요?

보통 targeting 하는 RNA를 전사하는 벡터는 U6 promoter--target sequence+gRNA scaffold+pol III terminator 구조로 되어있고 target seq.만 올리고 합성해서 넣는 구조로 구성된게 많습니다.
그리고 이 구조가 변화되면 타켓팅이 되지도 않구요. 또한 이 구조와 Cas9을 발현하는 시스템들이 보통은 함께 한 개의 플라스미드 벡터 안에 구성되어 있고요.

그리고 이해가 안되는 건  'stuffer가 멀쩡히 들어간 gRNA는 PCR하면 3.2kb에서 잘 뜹니다.' 부분이네요. 프라이머가 어떻길레 150 bp짜리가 3.2kb가 되는지(위에 700bp를 잘라냈다고 했는데)?

단순한 콜로니 PCR이 안뜨면 안된게 아닌지?
프라이머를 U6 promoter (약 200 bp 정도)의 5'쪽에서 한개 적당히 짜고 합성한 gRNA bottom strand를 나머지 프라이머로 하면 PCR하면 selection 여부를 알 수 있지 않을까요?

----- F primer
--------------------  -------
    U6 promoter             gRNA
--------------------  ------- R primer

HJ  |  2016.05.02    
저도 CRISPR는 약간의 경험밖에는 없습니다만..
일반적으로 vector에 oligo를 껴 넣는 것은 아주 쉬워서 실패하기가 어려울 정도인 실험입니다.

1. Oligo를 vector에 집어 넣을 때, PNK는 필요 없는 경우가 많습니다.
Vector에 insert를 ligation할 때, 한쪽에만 phosphate가 붙어 있으면 대부분 잘 ligation됩니다.
위의 경우라면 BsaI으로 잘린 vector에 phosphate가 있기 때문에 굳이 oligo에 안 붙여도 잘 되어야 정상입니다.
저희는 Feng Zhang의 PX459 plasmid를 주로 사용하는데, 이것도 T4 PNK를 사용하는게 좋다고는 되어 있으나, PNK 안 쓰고도 매번 colony 수백개씩 뜹니다.

2. Oligo 농도를 줄여보세요.
Vector-insert ligation시 optimal한 비율은 mole 수 기준으로 1:2 ~ 1:10 정도입니다.
위와 같이 oligo를 그대로 사용하면 insert인 oligo가 농도가 너무 높아서 오히려 제대로 된 plasmid가 안 만들어 집니다.
배워 온 대로 1:200 정도로 희석해서 해 보세요.

3. 가능하면 full sequence를 알고 있는 상태로 cloning하세요. 괜히 고생만 합니다.
시퀀스를 가르쳐주지 않는다면, primer walking을 해서 그냥 full sequence 뜨세요. 결과적으로는 그게 시간 낭비 돈 낭비를 줄입니다.
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