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 전체 > Molecular Biology-DNA > PCR/RT-PCR/Q-PCR
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질문 Taq+Pfu polymerase
올챙이이G짱  | 2016.04.15 22:42
PCR을 진행 시퀀스 에러가 없어야 하기에 Taq을 쓰다가 현재Pfu를 사용하려고 합니다.
Pfu 사용시 말단이 Blunt로 되기에 제한효소를 이용한 Cloning을 진행하여야 한다고 알고 있습니다.
Tag을 사용할 경우 끝에 T를 붙일 수 있다고 하는데, Taq와 Pfu를 혼합하여 사용한다면
Taq에 의해 T-cloning도 가능하고 Pfu에 의해 proofredading 또한 가능할지요?
그리고 Pfu만 사용하여 제한효소 처리 후 Cloning 할 경우 T-cloning을 제외하는데 
이런 경우는 
PCR ->gel extraction -> 제한효소처리  -> ligation ~~~~~~ 쭈욱
실험을 진행하면 되는지요?
Taq hot start와 Pfu를 비교할 경우에도 Pfu가 훨씬 더 정확한지요..?

그리고 PCR 진행 시 Template의 양이 너무 많으면 PCR이 진행되지 않는 경우가 있다는데
이런 경우는 왜 그러하죠? 


많은 도움 부탁드립니다!
#PCR
 
#Pfu
 
#Taq
답변하기
답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
타박  |  2016.04.16    
* Tag을 사용할 경우 끝에 T를 붙일 수 있다고 하는데, Taq와 Pfu를 혼합하여 사용한다면 Taq에 의해 T-cloning도 가능하고 Pfu에 의해 proofredading 또한 가능할지요?
-> 가능합니다. 실제로 그렇게 쓰라고 Taq 과 Pfu 를 섞어놓은 kit 도 판매되고 있습니다. 저 같은 경우는 Pfu 만 가지고 PCR 한 다음에 pufify 해서 Taq 과 dATP 만 넣고 A-overhang 붙여서 TA cloning 합니다. (Taq 이 끝에 붙이는 건 T 가 아니고 A 입니다)
귀찮을 때는 Pfu 로 PCR 한 다음에 final extension 직전에 끊고 Taq 추가해서 final extension 하기도 하고 그랬습니다. 길이가 길지 않으면 나중에 시퀀싱으로 확인한다는 생각으로 그냥 Taq 만 가지고 진행하기도 하고 그랬습니다. Taq 쓴다고 막 에러가 쏟아지고 그러지는 않습니다. 따라하실 경우 결과는 책임지지 않습니다(...)

* 그리고 Pfu만 사용하여 제한효소 처리 후 Cloning 할 경우 T-cloning을 제외하는데 이런 경우는 PCR ->gel extraction -> 제한효소처리  -> ligation ~~~~~~ 쭈욱 실험을 진행하면 되는지요?
-> 네 그렇게 하시면 됩니다. 대신 cloning 할 부분 양쪽에 원하는 제한효소 부위가 있어야겠죠. 아니면 만들어서 붙이거나.

* Taq hot start와 Pfu를 비교할 경우에도 Pfu가 훨씬 더 정확한지요..?
-> 네 그렇습니다. hot start 는 정확도를 올리는 것보단 PCR 의 첫 단계에서 실온에서 initial denaturation 온도까지 올라가는 동안 낮은 온도에서 non-specific amplification 이 일어나는 것을 막기 위한 것입니다.

 * 그리고 PCR 진행 시 Template의 양이 너무 많으면 PCR이 진행되지 않는 경우가 있다는데 이런 경우는 왜 그러하죠?
-> 프라이머와 polymerase 가 막 돌아다니면서 맞는 곳을 찾아서 붙고 DNA 합성을 진행해야 하는데 template 가 너무 많으면 걸리적거려서 움직이기 힘들다... 정도로 이해하시면 되겠습니다.


올챙이이G짱  |  2016.04.16   
선배님의 섬세한 답변 감사드립니다.

덕분에 많은 궁금증이 해결되고 나아가야할 방향을 잡을 수 있겠어요.

한주의 피로를 풀수있는 주말되세요~ 감사합니다.
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