실험 Q&A Mol. Biol.-RNA > mRNA Analysis
real-time PCR 을 이용한 유전자 발현 분석 실험하시는 분들, 도와주세요.
virology (비회원)
안녕하세요. real-time PCR 을 이용한 유전자 발현 분석 실험을 진행하고 있습니다.
현재 lab에 선배가 없는 상황이고,
지도 교수님께서도 과제 관련실험과 논문쓰기에 급하셔서
비과제 실험인 제실험의 trouble shooting을 해주지 않아 몇개월째 나아가지 못하고 있는상황입니다.
전혀 기존의 lab protocol이 없는 상태에서 구글링과 브릭 및 여러 참고 논문들을 통해
여기까지 왔지만 한계에 부딪혀 도움을 청해봅니다.
제 실험은 virus 감염 cell과 비감염 cell(mock)을 대상으로 시간별로 RNA를 추출하여
target gene의 발현을 보고자 하는 실험입니다.
사용한 cell은 overnight serum starvation 후 virus 감염후 시간별로 수확하였고
RNA추출 후 nanodrop으로 농도를 측정하여 total RNA 100ng 으로 RT를 진행하였습니다.
그 후 SYBR을 이용하여 real-time PCR을 통해 결과를 보았습니다.
Ct값 예상 1차실험(total RNA 100ng) 2차실험(500ng)
target virus infected cell 낮게 20~25(시간별로 경향성 X) 20~23
gene mock 높게 20~25(시간별로 경향성 X) 25~30
beta virus infected cell 일정 20~25(시간별로 경향성 X) 20~23
actin mock 일정 20~25(시간별로 경향성 X) 30 이상
예상했던 결과와 현재 상황을 정리해보자면 이렇습니다.
저의 예상은 위와 같이 beta actin은 일정한 ct 값을 가지고
virus 감염된 세포는 비감염세포에 비해 시간별로 특정 gene의 발현을 높게 보이는 것을 확인하고 싶었습니다.
그런데 1차실험결과 엉터리였고ㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋ....하........
RT 시 template RNA 양이 너무 적었다고 판단하여 500ng로 늘려 진행하였습니다.
그랬더니 또 제 3의 결과가 나와 더이상 저는 어떻게 해야할지 모르겠습니다.
house keeping gene은 늘 일정하다고 배웠는데
물론 약간의 차이는 있을 수 있으나 비감염세포는 30이상의 값이 나왔습니다.
real time ct값이 30 이상이면 거의 신뢰성이 낮거나 없다고 판단하는 것이라고 들었습니다.
제실험의 뭐가 문제일까요?
1. virus 감염 실험시 serum starvation 후 진행하는 것이 맞는지
(target gene의 발현이 serum에 영향을 받는다는 reference를 보아 그렇게 진행하였는데
같은 gene을 이용한 다수논문에서는 언급되어있지 않은 경우가 많아서 혹시나하고 여쭤봅니다.)
2. 1차실험에서보다 2차실험에서 오히려 더 CT 가 높아진 것은 무슨 경우일까요?
3. 왜 house keeping gene이 감염세포와 비감염세포에서 차이가 날까요?
4. house keeping gene을 바꿔볼까요? (gapdh나 등등)
많이 길어졌는데 읽어주셔서 감사합니다. 좋은 저녁되세요.
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