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 전체 > Molecular Biology-DNA > Sequencing
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질문 gene cloning 후 sequencing error 질문드립니다 ㅜㅜ
seq  |  2016.03.25 11:58
답변있는 질문은 수정/삭제 불가(☞문의)
첨부파일 파일첨부: 그림1.gif (93 KB)
이미지 첨부파일

학부, 석사 때부터 gene cloning 해서 확인차 업체에 sequencing 의뢰했었는데요.

예전에 pcr product 로 cloning 할 때 한번 point mutation 이 생겼는데

지금은 template DNA(commercial DNA 구매한것)에서 enzyme site 맟춰 insert 로 쓸 DNA를 gel extraction 합니다.

그런데 cloning 하여 sequencing 결과를 보면 자꾸 중간 중간에 DNA seq. 가 matching 안됩니다.

혹시 gel band 자를 때 uv에서 오는 문제인가 싶어 이번에는 uv도 최소한으로 쬐어주며 잘랐는데 .. ㅠㅠ 

어디서 오는 문제인건지... 깔끔하게 matching 돼야 다음 실험으로 진행하는데요

gene cloning 고수 분들의 답을 듣고싶습니다..

#gene cloning
 
#sequencing
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리강시  |  2016.03.25   
sequencing peak를 보셨나요?
씨컨스가 텍스트 파일로도 오지만 peak 파일로도 오지 않나요?
그러면 씨컨스 읽힌것과 피크가 잘 매치 되는지, 혹시 피크가 겹치거나 빠지지는 않았는지 하나하나 확인하는게 좋습니다.

혹시 클로닝 하기전의 PCR product도 함께 씨컨싱해보는것도 좋습니다.
왜냐하면 PCR pdoduct는 원래 유전자 sequence와 sequecing이 잘 매치되었는데 클론만 이상하다면 다시 클로닝해서 여러 클론을 sequecing해야 맞는 클론을 확보할 수 있지요.

만일 PCR product조차 원래 알려진 유전자 씨컨스와 다ㄹ게 나온다면 클로닝할때 사용한 template가 알려진 씨컨스와 다른것입니다.
sdf  |  2016.03.25    
commercial DNA의 경우도 sequencing하셔서 확인해보신 후 사용하셔야 합니다.


사실 gel extraction시 UV exposure에 의한 mutation은 겪어보지 않았는데 우선적으론


위에말씀드린 상황을 확인해보세요.


윗분말씀대로 peak도 확인해보시는게 좋을 듯합니다. 다만sequencing peak의 문제는 보통


sequencing 끝부분에서 일어나는게 대다수인점을 감안하시길 바랍니다.
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