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레벨5
pegasus
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16.03.20 12:21
제가 지식이 일천하여 설명하신 것에 대해 약간의 혼동이 오네요.
일단 IHC를 하려면 조직은 동결절편을 이용하거나 파라핀블록을 사용하셨을 겁니다.
일반적으로, 파라핀 블럭의 경우, 조직 슬라이드를 만들기 위해
fixation (NBF나 PFA) => 조직 처리(tissue processing) => 포매(embedding; 조직에 파라핀을 침투시키는 과정) => 조직 박절 => 염색 이과정을 거치게 되는데,
보통 파라핀 조직의 경우는 약 45도 온도의 물에 박절한 절편을 띄우면 조직의 주름이 펴지며 이때, 조직을 슬라이드에 붙인 후 말린 후에 파라핀 제거 과정을 거친 후 염색을 진행하시면 됩니다.
동결절편의 경우
fixation (NBF나 PFA) => 30% sucrose => OCT compund로 block제작 => 조직 박절 => 슬라이드에 붙인 후 염색 이 과정을 거치게 됩니다.
설명하신 것을 보면 이과정에서 OCT compound로 조직 절편을 만들어 well 에 담근 후 붓을 이용해 조직에 붙이는데 쭈글쭈글 해진다고 말씀하시는 것 같으신데, DW 말고 PBS에 담궈서 작업을 진행하는 것을 추천 드립니다.
그리고 마운팅을 하실 때는 붙이고 나서 기포를 밀어서 빼겠다는 생각을 하시기 보다는 커버글래스를 덮을 때 부터 마운팅 solution의 표면장력을 이용하여 덮어 기포가 없게 작업하시는 것을 연습하시기 바랍니다.
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답변감사합니다
(비회원)
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16.03.20 14:03
제가 좀 혼동되게 적어놓긴 했으나,
동결건조의 과정을 거쳐서 OCT compound로 도말하여
Cryocut으로 절편을 잘라둔것을 embedding을 하고 있습니다.
말씀하신대로 D.W 대신 1x PBS에 풀어서 해보겠습니다.
xylene에서 꺼낸 후 permount의 표면장력에 의해 기포를 제거해보려고
노력은 하는데, 너무 많이 뿌리게되면 덮다가 아얘 cover glass 위로 삐져나와서
대형참사가 벌어지는 바람에 한방울 두방울 정도만 떨어트려서 쓰게 됩니다.ㅠㅠ
(워낙 점성이 있는지라 pippet을 쓰지않고 스포이드달린 것으로
방울을 조금씪 떨어트려 사용중입니다.)
답변 감사합니다!.