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질문 sonication때문에 soluble protein이 insoluble로 갈 수 있나요?
최승혜  | 2008.02.27 13:03
답변있는 질문은 수정/삭제 불가(☞문의)
mbp를 퓨전시켜서 재조합단백질을 대장균에서 생산하였습니다.
소니케이션으로 셀을 깨서 soluble로 발현된 것을 정제하려하는데...
ep tube에 소량깨면 괜찮은데...
대량으로 셀을 깨면 대부분이 insoluble로 갑니다.

100ml에 10g정도 셀을 녹이고 15초깨고 5초 쉬고 해서 토탈 30분 정도 셀을 깹니다.
셀 깰때 버퍼는 pbs를 사용하고요
소니케이터는 콜파머 소믹스 제품으로 150ml까지 깰 수 있는 팁을 사용합니다.
얼음물에 넣어서 깨구요
열은 많이 발생하지 않습니다.

셀이 너무 많나요??
모두 깨지기는 하는 것 같은데요...

13000rpm, 10min 4도 (3번)
soluble fraction을 0.45um로 filtration해서 정제합니다.
정제는 되긴 하는데 발현양에 비해 양이 적습니다.

셀을 깨는 방법이 잘못 된 건가요 아님 센도리를 잘못 돌린건가요?
센도리를 3번 정도 안 돌리면 필트레이션이 잘 안 됩니다.
정제하기 위해서 로딩샘플로 사용하려면 필트레이션을 꼭 해야하기 때문에...






#sonication
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리엘피스  |  2008.02.27   
왜 그런 현상이 나왔는지는 직접 보지 않으면 알수 없는터라 결론적인 말씀만 드리면, sonication에 의해 soluble이 insoluble로 되지는 않습니다.
개구리이동우  |  2008.02.27   
cell이 모두 안깨진 것으로 보입니다..
sonication은 팁은 어떤걸 사용하시는지요..
질문을 보아하니 Microtube용 팁으로 100ml을 깨시는 것 같은데..

30분만에 깨려면 Microtube용 팁보다 더큰 것을 사용하셔야합니다..
얼음에 박아서 sonication 하는 것은 기본이구요..

Microtube용 팁으로 깨야한다면 일단 2시간은 기본적으로 Sonication 한다고 생각하시면 됩니다. 처음에 대장균을 suspension 시키면 탁한 우윳빛이 나지요..
10초하고 15초를 쉬시던가 해서 열이 최대한 발생하지 않도록 하시면서 2시간 정도 지나면 탁한 우윳빛에서 맑은 갈색을 띄게 됩니다..
맑다는 것은 투명한 것이 아니라.. 뭐랄까.. 경험을 해보시면 알텐데..
탁한.. 흙탕물 같은 것이 아니라 BSA를 녹이면 맑은 노란색이 나오는 것처럼..
맑고 진한 갈색이 나옵니다..''

그때 12000rpm 이상으로 centrifuge를 하시면 됩니다..

그리고 filtration 하시구요.. 용도는 잘 모르겠지만.. 전 단백질칩에 적용할 거라
0.45 후 0.22까지 하였습니다..
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