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 전체 > Chemical biology
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질문 혈장 원심분리 필요한 재료와 절차(고수님들 도와주세요 ㅠㅠ)
알알고싶어요  | 2016.02.04 21:44
안녕하세요. 이번에 혈장 원심분리 실험에 들어가는
실험 초짜입니다. 우선 실험 셋팅을 진행하는 중인데
필요한 재료부터 막히네요... 채혈부터 시작해서
혈장 원심분리 후 Deep freezer에 냉동보관 후
배송을 해야 합니다. 1명당 10ml 정도 채혈을 진행하고요.

원심분리기는 Hanil Micro-12구요.

채혈에 필요한 재료가 일자형 베큠니들(Vacutainer)과 베큠니들 홀더
채혈 bottle(EDTA)와 토니켓과 반창고.

원심분리시 필요한 재료가 피펫팁, 원심분리기, 라텍스 장갑

냉동보관을 위해 혈장을 걷어 EP tube나 stock vial(corning)에
넣어 약 -50도 정도에 보관하면 될까요?

*제가 궁금한 점이 EDTA 자체를 원심분리해도 될까요?
*보통 3000rpm에서 5-10분 돌리시는 것 같은데... 맞나요?
*EDTA에서 혈장 분리 후 EP tube나 Stock vial에 옮겨 담아
*deep freezer에 보관하면 될까요?
*위 재료나 절차 중 수정사항이 있을까요?
*냉동 보관 후 추후 분석을 위해 한번에 보내려고 합니다.
#혈장
 
#원심분리
 
#채혈
답변하기
답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
개구리앙마뿅  |  2016.02.05   
EDTA 튜브에 동일한 양의 혈액이 들어가 있고 원심분리기에 넣는 칸이 있으시다면 분리는 자체 원심분리가 가능하십니다. 그리고 저는 3,000 rpm으로 15분을 돌립니다.
그런데 10 ml의 혈액 후 혈청을 제외하신다면 혈장이 꽤 많은 양이 나올텐데 아마 그건 고려하셔야 할껍니다. 제 예상으론 대략 혈장이 8 ml 내외가 되지 않을까 싶습니다. 혈액은 초 저온 냉동고(-80도) 보관을 권장해 드리니다. 분석 보내실 때 아마 당일 퀵으로 해서 빨리 보내셔야 할 것 같네요.
160205  |  2016.02.05    
첨부파일 파일첨부: KakaoTalk_20160205_143635250.jpg (107 KB)
이미지 첨부파일

저는 첨부파일로 올려드린 사진과 같은 Tube를 쓰구요,
전혈이 6ml가 들어가는 크기이고
혈장을 분리하면 약 3ml정도가 나옵니다.

보관은 단기간 하실거면 -20도에서 하고
장기간 하는경우 -70~80도 deep freezer에서 하는데
보관용 Tube는 질소탱크에 들어가는건 아니니 일반적인 1.5ml ep Tube에 보관합니다.

보통 4도 3000rpm 이상에서 10분 원심분리 해주는데 저는 4도 3500rpm 10분 합니다.

혈장 Tube안에는 혈액응고 방지제가 들어있지 않기 때문에
채혈 즉시 위아래로 몇번 흔들어주고
(너무 많이 흔들면 RBC가 깨져서 혈장을 분리했을때 빨갛게 됩니다.)
1시간 이내에 원심분리를 해야합니다.
혈청 Tube안에는 혈청과 RBC를 완전 분리 해주는 반고체(?) 물질이 들어 있지만
혈장 Tube 안에는 아무것도 안 들어 있으므로 원심분리 기계에서 조심스럽게 꺼내서
혈장을 파이펫으로 따낼때 RBC가 딸려 올라오지 않도록 조심해야 합니다.

채혈용 알코올 솜도 필요 합니다.

알알고싶어요  |  2016.02.05   
답변하여 주신 두 선생님 모두 감사 드립니다.
아래의 사항 생각하여 봤는데 검토 부탁 드립니다 ㅠㅠ


1)10ml 채혈 후 EDTA tube(별도로 항응고처리 필요없지요?) 6.0mm 2개에
5mm씩 담은 후 4도 3000-3500rpm으로 10-15분간 원심분리
2)혈장을 일반적인 1.5ml ep Tube에 옮겨 담고(8ml 정도 5-6개 나오겠지요?)
3)-80도 정도에 보관을 한후 분석을 위해 보낸다(샘플들을 모아서 보내야하기 때문에
초저온 냉장고에서 6개월 이상 보관을 할수도 있을텐데 괜찮을까요?)

*EDTA에 항응고제가 포함되어 있어서 별도로 추가할 것은 없지요?
*ep Tube에 혈장 담은 후 그대로 초저온 냉장고에 보관만 하면 될까요?
*별도로 주의할 사항이 있을까요?


ㅁㄴㅇㄹ  |  2016.02.05    
1. 10mL EDTA tube (대표적으로 BD Vacutainer EDTA tube, lavender lid, Catalogue #367525) 에 10mL blood 채혈 
2. 10회  gently invert (Do NOT shake)
3. 2000 g for 10 min centrifuge (rpm 은 고정된 수치가 아님.)
4. 2mL screw-cap tube 에 1mL x 5 개 Plasma  aliquot (오염 방지를 위해 모든 plasma를 다 취하지 않는다)
5. -20도에서 25분 보관 (중요 ! )
6. -80 도에서 장기 보관 
7. 필요시 배송 (한번에 5개 시료 다 보내지 않는다. 배달 사고 방지. back-up 시료는 항상 있어야 함) 
160205  |  2016.02.05    
1)10ml 채혈 후 EDTA tube(별도로 항응고처리 필요없지요?) 6.0mm 2개에
5mm씩 담은 후 4도 3000-3500rpm으로 10-15분간 원심분리
(ml를 mm로 잘못 쓰신거죠?? 근데 처음부터 6ml튜브에 안 뽑으시고 10ml 뽑은 뒤 나눠 담으시는 이유가...
그런데 검색을 해보니 EDTA도 heprin과 같은 기능을 하는 거였나 보네요;;
항응고처리 없어도 될것 같습니다.)
2)혈장을 일반적인 1.5ml ep Tube에 옮겨 담고(8ml 정도 5-6개 나오겠지요?)
3)-80도 정도에 보관을 한후 분석을 위해 보낸다(샘플들을 모아서 보내야하기 때문에
초저온 냉장고에서 6개월 이상 보관을 할수도 있을텐데 괜찮을까요?)
(불안하시면 질소탱크에 보관하셔도 됩니다. 단, 질소탱크 보관시 꼭 cryo tube에 넣어 주셔야 합니다.
뚜껑이 밖으로 닫히는 tube는 혈장이 녹으면서 터질 위험이 있기 때문에 안으로 닫히는 tube로 구매를 하셔야 합니다.)

우선 상대방이 필요한 양이 얼만큼인지가 중요할것 같습니다.
혈장은 얼렸다 녹였다를 반복하면 상태가 안 좋아지고 데이타 변동의 우려가 있기 때문에
한번 사용할 만큼씩 나눠 담는 것이 좋습니다.
튜브를 너무 꽉 채워서 보관하시면 얼면서 tube 뚜껑이 열리거나 터질수 있으므로 공간을 조금 남겨 두세요.
어느분이 채혈 하시는지는 모르겠지만 채혈을 하면서 RBC가 깨지는 경우도 있다고 하니 능숙하신 분이 채혈 하시는게 좋을것 같고
채혈 후 채혈 tube를 심하게 흔들지 마세요.
보내실때는 storage box에 혈장이 담긴 tube를 넣고 아이스박스안에 넣은 뒤 드라이아이스를 채워넣고 뚜껑을 닫은 뒤 새어나가는 구멍이 없도록 테이핑을 해주세요.
알正反合  |  2016.02.05   

선생님 두분 친절한 답변 정말 감사 드립니다^^

현재 랩에 있는 원심분리기는 1.5-2.0mm 용이라
우선 채혈을 10mm 이상 tube에 한 후에 다시

EDTA tube 2mm(5-6개)에 옮겨 담은 후 원심 분리하고
혈장을 다시 EP tube 2mm(4-5개)에 옮겨 담아야겠네요.

배송시에는 전문업체를 이용해 보려합니다.
보관은 Deep freezer에 Tube rack에 보관하려는데
배송시에도 Tube rack 그대로해서 보내면 될까요?

말씀해 주신대로 안으로 닫히는 튜브 그리고
사고방지를 위해 따로 배송해야겠습니다^^

혹시 직접 드라이 아이스 포장해서 배송해보신 분 있나요?
전문업체를 이용해서 운송하는 방법이 꽤 비싸더라구여 ㅜㅜ

asdf  |  2016.02.11    
바람직 하지 않읍니다. 

사람이면 병원에서  Plasma  aliquot 까지 병원에서 해야 하구요. Vacutainer kit 을 사용하지 않으면 병원에서 안해 줄것이구요.  당연히, 10mL centrifuge  도 있을 것이구요.


동물이라면 조금 복잡해 집니다.  

초심자로 보이시는데, 숙련되지 않으시면 혈액 취하는 과정에서 
 혈액 응고가 일어 날 것입니다. 


초보군  |  03.03 22:25   

혈장 분리 후 EP tube나 Stock vial에 옮겨 담아도 된다고 하셨는데 Stock vial은 cryotube를 말하는 건가요?

 

분리 후 보관시 screw cap tube도 권장하던데 왜 cap을 따로 쓰는게 좋은건지 이유 좀 알려주세요 ㅠㅠ

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