실험 Q&A Microbiology > Virus
gateway system 이용한 lenti virus cloning
gateway system (비회원)
안녕하세요? ^^ 저는 현재 gateway system 을 이용해서 lenti virus 를 클로닝 하려고 하고 있습니다. RNA를 뽑아서, cDNA로 합성한후, enzyme site(EcoR1/Xho1)가 붙은 primer 로 증폭한후, enzyme cutting 한 후 elution 하였습니다. 벡터는 pENTR1A를 사용했고, PCR product 와 동일한 enzyme 으로 cutting 하였습니다. ligation 은 T4 ligase 를 이용하였고, 16도에서 o/n으로 처리하였습니다. ligation 한 후에 EP로 ligation 된것을 확인하였습니다. 컴셀은 DH5a cell- HIT competent cell - 을 사서 42도에서 1분간 heat shock 한후에 200ul LB bloth 섞어서 바로 kanamycin 50ug/ml plate에 seeding하여 37도 인큐베이터에 o/n으로 키웠습니다. 그런데~!!!!!!!!! 콜로니가 전혀 단 한개도 나오지 않았습니다. pENTR 벡터에 ccdb gene이 박테리아를 못 자라게 한다해서, 벡터는 두번이상 cutting 하였고, CIP를 약 한시간 처리한 후 ccdb 가 완전히 제거된 상태에서 ligation 진행하였습니다. cutting 안한 벡터만도 plate에 seeding 했는데... 콜로니가 나왔습니다. 약 0.5ug/ml 처리했는데, 콜로니가 약 100개정도 나왔습니다. - invitrogen 에 문의해보니, 원래 벡터 자체에 ccdb gene이 포함되어 있어서 자라면 안된다고 하더니.... 오후에 다시 통화를 해보니... 다시 자랄수도 있다고 하네요...ㅜㅜ- 도저히 왜 그런지 모르겠습니다. 메뉴얼을 잘 읽어보아도, 전혀 이유를 모르겠습니다... ㅜㅜ 도와주세요.... 왜 콜로니가 전혀 안 생기는 걸까요? 셀프 라이게이션조차 없어요... ㅜㅜ
Bio마켓 프리미엄