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 전체 > Molecular Biology-DNA > Sequencing
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질문 16s rRNA 염기서열로 세균 동정시
알셈셈  |  2015.11.25 20:04
안녕하세요 ㅠㅠ 임상병리학과 2학년에 재학중인 학생인데, 분자생물학을 공부하다 모르는게 생겨서 질문 올립니다!

1. 절차를 보면 PCR 후에 부산산물 제거하고 또 cycle squencing이란 절차를 거치던데 이 싸이클 시퀀싱이 PCR 과 비슷한 방법인거같던데 PCR과의 차이점이 뭔가요? 그리고 왜 PCR후에 싸이클 시퀀싱을 또 하는지 궁금합니다...

2. 결과를 보면 2개의 peak가 겹치는 경우 or 1개의 peak가 넓게 나타나 2개의 염기로 판독될 수있어 reverse, forward primer를 모두 사용한다는데
세균 동정시 peak는 어떤 의미로 쓰이는건가요?? 세균의DNA 가닥인가요?
#cycle sequencing
 
#peak
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
1. cycle sequencing 이라는게 dideoxynucleotide를 이용한 방법을 말하는 것 같은데
  위 dideoxynucleotide를 이용한 chain termination sequencing방법이 뭔지 공부하시면 쉽게 감 잡으 실 수 있을 것 같습니다.
 즉 쉽게 말하면 넣어준 DNA가닥을 증폭 해 나가면서 한사이클이 끝난뒤 염기가 A,G,C,T중 어느녀석이 붙었는지 보고 그다음 한사이클 돌리고 어느녀석이 붙었는지 보고 그다음 또 ......
 이런 식 입니다. 어느녀석이 붙었는지 보는건 염기마다 다른형광을 써서 그걸바탕으로 detect합니다.


2. 2개의 peak 라는건 아무래도 위에 말한 sequencing 결과에서 염기의 peak를 말하는 것 같은데.
 위와같은 방법으로 진행하고 난 뒤 각 bp위치마다 어떤염기가 가장 형광값이 가장 높게 나왔는지 그 peak를 확인하는데요, 이 때, 2개의 peak가 겹칠 수 있습니다. 예를들어 반복되는 서열 같은경우 이렇게 peak가 겹칠 확률이 높아집니다. 
개구리Marine  |  2015.11.26   
Marine 님 답변에 제가 조금 덧붙이자면,

통상적으로 세균 동정에 사용하는 16S rDNA 서열은 1.5 kb 정도입니다.
그런데 sanger's sequencing (질문자께서 말씀하신 cycle sequencing)을 해보면
한 방향의 프라이머로는 그 길이를 모두 분석해낼 수 없습니다.

따라서 양 끝단에서부터 안쪽으로 읽어오는 방법 (27F-1492R primer set)이나
중심에서 바깥으로 읽어나가는 방법 (518F-800R primer set)을 사용하게 되면
1.5kb를 모두 분석할 수 있습니다.

예를 들어,
27F primer로 시퀀싱을 하다 보면 1000bp 내외서부터는 퀄리티가 떨어지게 되지만
1492R primer로 읽은 결과물과 대조하여 보완할 수 있고
최종적으로 1개의 contig를 만들 수 있는 것입니다.
개구리별숲  |  2015.11.26   
두분다 감사드립니다!! 많은 도움이 되었어요
Cycle sequencing으로 아무리 검색해도 나오지 않더니.. Sanger's method로 검색하니 바로 많이 나오네요 ㅠㅠㅠ 감사합니다♥
알셈셈  |  2015.11.26   
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