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레벨5
Marine
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15.11.26 10:12
1. cycle sequencing 이라는게 dideoxynucleotide를 이용한 방법을 말하는 것 같은데
위 dideoxynucleotide를 이용한 chain termination sequencing방법이 뭔지 공부하시면 쉽게 감 잡으 실 수 있을 것 같습니다.
즉 쉽게 말하면 넣어준 DNA가닥을 증폭 해 나가면서 한사이클이 끝난뒤 염기가 A,G,C,T중 어느녀석이 붙었는지 보고 그다음 한사이클 돌리고 어느녀석이 붙었는지 보고 그다음 또 ......
이런 식 입니다. 어느녀석이 붙었는지 보는건 염기마다 다른형광을 써서 그걸바탕으로 detect합니다.
2. 2개의 peak 라는건 아무래도 위에 말한 sequencing 결과에서 염기의 peak를 말하는 것 같은데.
위와같은 방법으로 진행하고 난 뒤 각 bp위치마다 어떤염기가 가장 형광값이 가장 높게 나왔는지 그 peak를 확인하는데요, 이 때, 2개의 peak가 겹칠 수 있습니다. 예를들어 반복되는 서열 같은경우 이렇게 peak가 겹칠 확률이 높아집니다.
Marine 님 답변에 제가 조금 덧붙이자면,
통상적으로 세균 동정에 사용하는 16S rDNA 서열은 1.5 kb 정도입니다.
그런데 sanger's sequencing (질문자께서 말씀하신 cycle sequencing)을 해보면
한 방향의 프라이머로는 그 길이를 모두 분석해낼 수 없습니다.
따라서 양 끝단에서부터 안쪽으로 읽어오는 방법 (27F-1492R primer set)이나
중심에서 바깥으로 읽어나가는 방법 (518F-800R primer set)을 사용하게 되면
1.5kb를 모두 분석할 수 있습니다.
예를 들어,
27F primer로 시퀀싱을 하다 보면 1000bp 내외서부터는 퀄리티가 떨어지게 되지만
1492R primer로 읽은 결과물과 대조하여 보완할 수 있고
최종적으로 1개의 contig를 만들 수 있는 것입니다.
두분다 감사드립니다!! 많은 도움이 되었어요
Cycle sequencing으로 아무리 검색해도 나오지 않더니.. Sanger's method로 검색하니 바로 많이 나오네요 ㅠㅠㅠ 감사합니다♥