실험 Q&A Mol. Biol.-DNA > Gene Cloning
2개의 제한효소로 잘랐을 때.. (질문 약간 수정)
enzyme (비회원)
제가 BglII와 XbaI site를 붙여 T vector에 Cloning 하였습니다.. T vector에서 insert를 꺼내려고 위의 enzyme을 처리하였습니다.. 그런데 아래와 같은 방법으로 모두 해봐도 insert가 잘려 나오지 않습니다.. 도대체 문제가 무엇일까요??? 꼭 쫌 가르쳐주세요 ㅠㅠ 1. BglII 처리 ⇒ gel extraction (kit 사용) ⇒ XbaI 처리 : BglII 처리 결과 1-cut으로 확인됨. 하지만 두번째로 XbaI 처리 결과 DNA 크기 변함 없음. 그대로 1-cut임. 2. XbaI 처리 ⇒ gel extraction (kit 사용) ⇒ BglII 처리 : XbaI 처리 결과 1-cut으로 확인됨. 하지만 두번째로 BglII 처리 결과 DNA 크기 변함 없음. 그대로 1-cut임. 3. BglII, XbaI (buffer 동일한것으로 가능함) 동시 처리 : 어떤 enzyme에 의해서인지는 알 수 없지만 1-cut으로 확인됨. 결국 2-cut으로 잘리는 것을 확인 못했습니다.. 어떻게 해봐도..ㅠㅠ 분명 sequence 확인 결과 문제가 없었고.. 따로따로 enzyme 처리해보면 잘리는 것을 봐서 enzyme에도 문제가 없는 것 같은데.. 도대체 이해할 수 없습니다.. 혹시나해서 BglII와 T vector에 살아있는 enzyme으로 처리해봤더니, 그때는 2-cut이 됩니다.. 뭐가 문제일까요?? BglII와 XbaI을 쓸 경우 둘 사이에 어떤 방해작용이라도 있는걸까요?? 참고로 BglII : A''GATCT 이고 XbaI : T''CTAGA 입니다.. TCTAG''A AGATC''T 그리고 enzyme은 모두 NEB 것입니다.. 제발 해결해주세요.. ㅠㅠ T vector(pGEM T-easy vector : promega), insert에도 BglII,XbaI site 모두 없어요.. Sequence도 2번이나 확인했는데 모두 맞구요...ㅠㅠ 뭔일일까요??
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