long bone면 어디를 말씀하시는 건가요?
저의 경우는 disc 에서 cell을 분리하는데요,,,,
원래 뼈조직이라,, cell이 다른 조직에 비해서 없는 건 사실입니다..
분리 후 5일뒤에 세포들이 분화된다고 하면,,, 한 7일 정도 기다려 보시는 것도 괜찮을 것 같구요,, 처음에 분리 후 cell을 flsk나 dish에 깔아줄때,, flask,dish의 크기나 배지의 양은 얼마로 하시는지,,, 왠만하면 처음에 깔아줄때는 배지가 바닥에 거의 깔릴 정도로만 넣어주는게 좋거은요,,, 그리고,, collagenase를 쓰신다고 했는데,, 이는 collagenase의 농도와 시간조절이 관건일 듯 합니다... 그리고 뼈조직은 그야말로 뼈 이기 때문에,, 잘게 부셔주는게,,, 도움이 되지 않을까요?

뼈는 Mouse 다리를 전부 이용하고 있습니다.
Collagenase 의 경우에는 Collagenase II와 DMEM을 섞어서 만들어 4mL정도로 하여 약 세시간 정도 water bath에서 incubate을 하고 있습니다. 혹시 이 시간이 너무 긴건가요??아니면 뼈 조각을 더 많이 잘게 부수는게 나을까요?

솔직히 전체 뼈를 사용한다고 하셔서 제가 감이 안 잡히는데요,,,.
분리가 된 cell을 무엇이라고 부르나요? cell 이름이요,,,

뼈 바깥쪽에 존재하는부분에서 cell이 분리가 되는거라면 근육제거시 메스로 큰 근육들만 제거를 하시고 collagenase를 처리하고 나면 어차피 근육들도 흐믈흐물 해지기 때문에 forcep등으로 떼어내시는게 좋을 듯 하구요,,,

저의 경우는 뼈 조직이라고 하여도 뼈내의 약간의 gelatin형태의 조직이기때문에 여러번의 파이펫팅을 통해서도 분리가 가능하긴하거든요,,,

제가 실험을 한다면 3시간 동안 collagenase를 처리하는 과정중에서
처음 1시간 30분 collagenase 처리후에 처음에 제거 안된 근육들을 제거하면서 뼈를 잘게 부숴주면서 잘게 부순뼈를 다시 collagenase를 처리하면 좀 낫지않을까 생각이 듭니다,, 도움이 되셨으면 하네요