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질문 tRNA assay 제발 도와주세요..
angio  | 2015.10.11 20:08
답변있는 질문은 수정/삭제 불가(☞문의)

tRNA를 분해하는 RNase의 활성 실험이 잘 안되어서 질문드립니다.
실험은 간단합니다.
yeast tRNA에 RNaseA를 농도별로 처리하여
4시간 incubation 후 센트리퓨즈를 통해 분해가 되지 않은 tRNA를 가라앉히고
상층액만 취하여 260nm에서 흡광도를 측정하는 것입니다. 

논문을 참고하여 조건을 그대로 하였지만
원하는 O.D값(0.5~1)보다 훨씬 높은 O.D값(1.7)이 나왔습니다.
RNase A 농도별로 달라야할 O.D값이 모두 같았고
심지어 control로 buffer에 tRNA만 들어가있는 것도
효소가 들어간 것들과 같은 O.D값(1.7)을 나타내는 것입니다.

실험을 준비하는 과정에서 RNA를 분해하는 다른 요소가 들어간 것인지
확인하기 위해 buffer와 3차수를 모두 오토클레이브로 멸균하였고
4시간 incubation을 하지않고 바로 tRNA만 buffer에 녹여서 O.D값을 측정했더니
O.D값이 1.7이 나왔습니다.
즉 tRNA는 효소에 의해 전혀 분해 되지 않았으며 buffer를 넣기 시작한 시점부터
이미 1.7의 O.D값을 지녔다는 것입니다.

아무리 실험 셋팅중에 RNA 분해 요소가 들어간다 할지라도
sample을 준비하여 바로 O.D값을 측정하는 그 짧은 시간에 tRNA가 모조리 분해된다고는
생각되어지지 않습니다. tRNA도 논문에서 쓰여진 것을 그대로 썼는데
어떻게 이런일이 생긴것인지 감도 잡을수가 없습니다.

한가지 의심되는것이 있다면 석영 큐벳으로 O.D값을 측정하는데
윗부분이 깨져있다는것 뿐입니다. 하지만 UV가 지나가는 투명한 부분엔
아무런 영향을 주지 않고 E.coli의 O.D값을 잴 때는 아무 이상이 없었습니다.

tRNA를 이용하여 활성 측정을 해보셨거나 이 실험을 해보신 분들의 조언을 구합니다.
감사합니다  

#tRNA
 
#Enzyme assay
 
#RNase A
답변하기
답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
sdf  |  2015.10.13    
tRNA 쪽은 안 해봤지만..
tRNA 자체가 1.7이면 rnase가 전혀 활성이 없다는 건데
rnase 체크나 양을 더 늘려야 하지 않을까요
angio  |  2015.10.13    

저희 실험실의 분광기기가 읽을수 있는 최대 한계가 1.7이고 그 이상은 다 1.7로 읽더군요
그래서 다른 실험실의 분광기기로 측정했더니 효소를 넣은것과 control의 O.D값이 달랐습니다.
하지만 논문을 보고 똑같은 조건으로 실험하였는데 결과값이 너무 크게 나와서
어떻게 해야할지 고민중입니다.

ㄹㄴㅇ  |  2015.10.13    
어 그럼 컨트롤을 블랭크로 잡아야 하는게 아닐지?

논문 제목 좀 알려주세요
angio  |  2015.10.13    
assay 방법을 참고한 논문 제목은
Ribonucleolytic activity of angiogenin: Essential histidine, lysine, and arginine residues
(Biochemistry 1987) 입니다.
table 1 아래에 tRNA assay 방법과 실험 condition이 나와있습니다.

그리고 참고한 Enzyme 농도 별 결과 O.D값은 
Role of glutamine-117 in the ribonucleolytic activity of human angiogenin
(Biochemistry 1994 ) 의 Fig 1 입니다.

신경써주셔서 감사합니다
angio  |  2015.10.13    

blank는 3차수로 잡는것이라고 실험 방법이 적힌 책에서 봤습니다.
논문 외에도 tRNA를 이용한 assay를 설명하는 것이 몇 있길래 찾아봤었습니다.

이 실험에서 효소 활성을 측정하는 방식이 tRNA가 분해되면 과염소산을 처리하여
분해된 tRNA 단편과 분해되지 않은 tRNA를 분리하여 상층액의 O.D값을 측정하는 것이므로
이론상 아무것도 처리하지 않은 컨트롤은 과염소산을 처리후 centrifuge 시 상층액은
260nm에서 O.D값이 0이 나와야 하지만 1.7이라는 값이 나옵니다.

처음에는 큐벳이나 측정기기를 의심했지만 지금은 3차수와 buffer를 고려하고 있습니다.
RNase free water를 사용하지 않아서 control에서도 tRNA 분해가 일어나는것이 아닌지
생각이 듭니다. 비록 오토클레이브를 통해 모두 멸균을 한 상태로 실험을 준비하였지만
RNase는 멸균을 해도 쉽게 없어지지 않는다고 하더군요
 

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