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tRNA assay 제발 도와주세요..
angio (비회원)
tRNA를 분해하는 RNase의 활성 실험이 잘 안되어서 질문드립니다.
실험은 간단합니다.
yeast tRNA에 RNaseA를 농도별로 처리하여
4시간 incubation 후 센트리퓨즈를 통해 분해가 되지 않은 tRNA를 가라앉히고
상층액만 취하여 260nm에서 흡광도를 측정하는 것입니다.
논문을 참고하여 조건을 그대로 하였지만
원하는 O.D값(0.5~1)보다 훨씬 높은 O.D값(1.7)이 나왔습니다.
RNase A 농도별로 달라야할 O.D값이 모두 같았고
심지어 control로 buffer에 tRNA만 들어가있는 것도
효소가 들어간 것들과 같은 O.D값(1.7)을 나타내는 것입니다.
실험을 준비하는 과정에서 RNA를 분해하는 다른 요소가 들어간 것인지
확인하기 위해 buffer와 3차수를 모두 오토클레이브로 멸균하였고
4시간 incubation을 하지않고 바로 tRNA만 buffer에 녹여서 O.D값을 측정했더니
O.D값이 1.7이 나왔습니다.
즉 tRNA는 효소에 의해 전혀 분해 되지 않았으며 buffer를 넣기 시작한 시점부터
이미 1.7의 O.D값을 지녔다는 것입니다.
아무리 실험 셋팅중에 RNA 분해 요소가 들어간다 할지라도
sample을 준비하여 바로 O.D값을 측정하는 그 짧은 시간에 tRNA가 모조리 분해된다고는
생각되어지지 않습니다. tRNA도 논문에서 쓰여진 것을 그대로 썼는데
어떻게 이런일이 생긴것인지 감도 잡을수가 없습니다.
한가지 의심되는것이 있다면 석영 큐벳으로 O.D값을 측정하는데
윗부분이 깨져있다는것 뿐입니다. 하지만 UV가 지나가는 투명한 부분엔
아무런 영향을 주지 않고 E.coli의 O.D값을 잴 때는 아무 이상이 없었습니다.
tRNA를 이용하여 활성 측정을 해보셨거나 이 실험을 해보신 분들의 조언을 구합니다.
감사합니다
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