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 전체 > Molecular Biology-DNA > Gene Cloning
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질문 엔자임사이트 단 올리고에 pfu 로 pcr하면...
@@  | 2008.01.17 10:08
답변있는 질문은 수정/삭제 불가(☞문의)
pfu polymerase에 대한 어떤분의 답변이..

----Taq polymerase는 높은 증폭율을 자랑하지만 error rate도 높아서 expression용 gene cloning에 적합하지 않습니다. Taq은 증폭된 DNA의 3'' 말단에 A를 하나씩 더 달아서 plasmid에 insertion시킬 때 소위 T vector라는 것을 사용하여야 합니다. 이에 반해서 pfu polymerase는 증폭율은 낮지만 정확도가 매우 높아서 발현용 유전자 클로닝에 적합한 합성효소입니다. pfu는 taq과 달리 증폭된 DNA의 말단에 아무 것도 달지 않기 때문에 blunt end product가 나옵니다. 따라서 클로닝시 어떤 vector에건 blunt end로 절단만 되어 있으면 ligation이 가능합니다. Taq과 달리 pfu는 속도가 매우 느리기 때문에 1Kb당 합성시간 1분 정도 주시면 됩니다.---

pfu는 taq과 달리 증폭된 DNA의 말단에 아무 것도 달지 않기 때문에 blunt end product가 나옵니다. 따라서 클로닝시 어떤 vector에건 blunt end로 절단만 되어 있으면 ligation이 가능합니다.
이말이 잘 이해가 안되어서요..

보통은 양쪽에 스티키하게 잘리는 두 엔자임(R가령EcoR1, BamH1)을 달아 디자인한 올리고와 템플리트, taq polymerase넣고 PCR하여 벡터와 인설트 각각
두 엔자임 잘라 라이게이션해왔는데요.

만약 위의 것처럼 스티키로 컷되는두 엔자임 단 올리고와 인설트 넣어 PFU polymerase
넣어 pcr하면 과연 어떨까요? pfu는 블런트엔드라고하는데 과연 스티키로 잘리는 엔자민 달아서 한 올리고 사용한 것인데 괜찮나요?

정말 답답하고 궁금합니다.
#pfu pcr
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
Mad Scientist  |  2008.01.17    
Oligo에 Restriction Site를 달아서 PCR하고, 이를 Restriction Enzyme으로 잘라서 벡터에 클로닝하는
경우라면 원래 PCR Product에 A overhang이 있든 (Taq Polymerase), Blunt End로 되어 있든 (Pfu Pol)
상관할 것 없습니다. 어차피 Restriction Enzyme에 의해 PCR Product 끝부분이 잘려서 Sticky End가
될 것이니까요.

"pfu는 taq과 달리 증폭된 DNA의 말단에 아무 것도 달지 않기 때문에 blunt end product가 나옵니다. 따라서 클로닝시 어떤 vector에건 blunt end로 절단만 되어 있으면 ligation이 가능합니다. "

라는 이야기는 PCR Product를 다른 Restriction Enzyme 처리없이 그대로 Cloning할때 해당하는 이야기입니다.
즉, PCR Product를 일단 vector (T-vector 등)에 클로닝해 두고, 이를 여러가지 다른 vector (가령 mamalian expression vector, bacterial expression vector, 기타등등) 에 서브클로닝하는 경우에 신경쓸 이야기입니다. 즉, 질문하신 분의 경우에는 신경쓰실 필요가 없습니다. 즉, Pfu건 Taq 이건 PCR만 나오면 아무거나 쓰면 됩니다. 단, Pfu등의 proofreading 기능이 있는 polymerase가 좀더 error 발생확률이 낮으니까 이것을 쓰면 좋다라는 이야기겠지요. (Taq의 경우라도 어차피 Sequencing 몇 개 맡겨서 제대로 된 넘 골라내면 상관없는 것은 마찬가지입니다)
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