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pfu를 사용할때는 조심해야합니다.
pfu는 proof-reading 기능이 있어서 mutation을 감지하고 수정해버립니다.
특히 primer의 3' 말단 근처에 mutation시킬 염기를 배치하면 pfu는 그걸 수정해 버립니다.
그 결과는 mutated primer를 사용해도 wild type이 증폭될 수 있다는 말입니다.
그래서 primer를 디자인할때 mutation 시킬 염기를 3' 말단에서 10-15nt 이후에 가도록 하는게 좋습니다.
프라이머의 GC 함량이 높으면 annealing 온도를 높이는게 맞습니다.
하지만 낮은 annealing온도에서도 nonspecific 합성이 있지만 원하는 크기가 나올 수 있습니다.
하지만 primer의 길이는 관계없습니다.
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hachrh
(비회원)
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15.09.24 16:37
강시님 답변감사합니다. primer상에서 mutation site가 24mer중 3'-end에서 15base 떨어져있고 그다음 3base를 바꿨습니다.
만약 annealing temp만 다른 조건에서 annealing temp를 올린다면 나오지 않았던 target band가 나타날수도 있는건가요??