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 전체 > Molecular Biology-Protein > Extraction/Isolation
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질문 sds-page 에서 well에서 로딩한 뒤 sample 이 내려가지 않아요ㅠ
알마이너스손  |  2015.09.22 01:28

실험실에 에서 공부하는 학부생입니다.
교수님이 bacteriocin을 sds-page해보라고 해서 sds-page하는데 잘 안되어 고수님께 여쭤봅니다.

우선 gel을 만드는 데요
 10%  running gel 10ml 기준으로
H2O                                            4 ml
30% acrylamide                          3.3 ml
1.5M tris ( pH 8.8 )                      2.5 ml
10% SDS                                   0.1 ml
10% ammonium persulfate            0.1 ml
TEMED                                  0.004 ml
위에서 부터 순서대로 APS 넣기전 vortexing 하고
APS와 TEMED를 조성보다 살짝 더 넣고 섞어서 만들었습니다.
평평하게 하기 위해서 에탄올 95% 짜리를 썼구요
굳는데 약 1시간반 이상 걸렸습니다. ---  첫번째 이상한 점
종이로 에탄올을 제거 한 뒤에

 5%  stacking gel 3ml 기준으로
H2O                                            2.1 ml
30% acrylamide                            0.5 ml
1M tris ( pH 6.8 )                         0.38 ml
10% SDS                                    0.03 ml
10% ammonium persulfate             0.03 ml
TEMED                                     0.003 ml
이것도 running gel 처럼 SDS까지 넣고 섞은 담에
APS와 TEMED를 조금 더 넣어 만들었습니다.
(이번에는 30분 안쪽으로 굳었구요 )

이렇게 gel을 2장 만들었구요
SDS-PAGE 카세트에 gel 을 끼운다음 SDS 탱크와 연결하고 running buffer를 카세트 안쪽부터 채웠습니다. 이때 탱크 가득 buffer를 채웠습니다.
10X running buffer의 조성(1L 기준) 은  이렇습니다.
 tris           30.275g
glycine        144.1g
SDS               10 g

10X 이다 보니 10배 희석해서 사용 했습니다.
이상태에서 전류 120V를 흘려 보내니까 mA이 5 안팍이고 기포도 잘 생기지 않더라구요
이상하지만 아무튼 실험을 진행 해 봐습니다. -----  두번째 이상한 점 

sample buffer와 sample을 섞고 3분간 100도시에 가열 했구요
10개의 well에 양옆으로 sample buffer를 넣고 marker 도 걸고 sample도 걸어 다시 120V로 흘려 줬더니 marker 든 sample이든 다 내려가지 않고 퍼지기만 하더라구요----  세번째 이상한점

어찌어찌해서 buffer도 바꿔주고 기기도 바꿔주고 해서 mA을 60까지 올리고 기포까지 잘 나오는 것을 확인했는데도 well에서 marker와 sample은 내려가지 않고 퍼지기만 합니다.ㅠ  
모든 시약들은 실험 하기 전에 만들었구요 (APS도 실험 전에 가루에서 10%로 만들었습니다. )

아무리 찾아봐도 well에서 sample이 내려가지 않는 이유를 모르겠어요ㅠ
running buffer에서 의심간다면 시약들 무게 잰 담에 1L 3DW를 채우고 섞어서 약간 부피가 증가했을 것입니다. 이게 시료들이 안내려올 정도로 민감한 부분인가요?

아님 acrylamide 이나 APS, TEMED 때문인가요??
아님 제손이 진짜 마이너스손인가요ㅠㅠㅠㅠ

#SDS PAGE
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
개구리seraphina  |  2015.09.22   
1. 잘 안굳는 다면 대부분 Aps 문제입니다. Aps를 fresh하게 만들어서 사용해보세요

3. 전류가 반대로 걸렸나 보네요. 샘플이 아래로 내려가지 않고 퍼졌다는건 양극과 음극을 반대로 걸어줘서 그랬을 확률이 높아보입니다.
알마이너스손  |  2015.09.22   

SDS-PAGE set를 보니까 빨간부분이랑 검은 부분이 있어서 빨간건 빨간것에 검은건 검은것에 연결 했는데 혹시 이렇게 연결하는 것이 아닌가요???

개구리seraphina  |  2015.09.22   
샘플버퍼 (로딩 dye)만들어서 사용하시나요?
샘플버퍼를 샘플과 섞기전 95도에서 5분정도 가열해줍니다.
예전에 샘플버퍼 가열한 뒤 다시 아이스에 박아서 샘플과 섞었던 적이 있는데
그때 샘플 버퍼에있는 sds와 단백질이 잘 섞이지 않아서 로딩 하자마자 샘플이 가라앉지않고 바로 퍼졌던 기억이있네요.
실수  |  2015.09.22    
혹시.... gel의 홈을 안쪽으로 해놓고 하신거 맞나요??
가끔가다 보면 홈을 바깥쪽에 위치하도록 세팅한 후 안내려 간다고 하는경우가 있었어서요
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