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 전체 > Molecular Biology-DNA > Sequencing
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질문 pET 21 계열 시퀀싱
뒷다리1q2w3e4r!  |  2015.09.06 22:51
안녕하십니까 선배님들.

제가 pET 21 b vector를 사용을 하는데 시퀀싱이 잘 맞지 않습니다.

기존에 pET 21b vector에 재조합을 하고 난 plasmid가 있습니다. 이 plasmid를 A라 하겠습니다.

이후 이 A로 transformation을 하게 되면 콜로니가 여러개 뜨는데 여기서 몇 개를 컬쳐한 뒤

시퀀싱을 T7, T7terminal에서 확인을 하는데

T7에서 확인한건 끝부분 his-tag까지는 거의 읽혀지지는 않지만 제가 원하는 서열까지 들어가 있는 plasmid가 확인이 되는데

T7ter에서 읽은 것은 좀 맞지 않는데요...

왜 그런 것일까요? 교수님께서는 T7으로 읽는건 정확하지가 않다라고 하시긴하는데.. 뭔가 좀 그래서요.

그렇다고 한 plate에서 따서 6개정도를 따서 확인을 해보면 T7은 5개가 맞고 T7teminal에서 읽은건 잘 맞지 않네요..(예를들면 T7terminal에서 읽은건 뒤에서 읽어가다보니 his부분은 정확한데 끝쪽으로 가면 갈 수록 영... 안 맞는데...) 원래 끝에부분에서는 정확하지 않는건 알겠지만
T7에서 읽을 때랑은 너무와도 달라서 쉽사리 진행하기가 어려운데

선배님들은 어떻게 생각하시는지요?

다시 읽고 고쳐서 질문을 하지만 제대로 의미 전달이 되는지 모르겠네요.

transformation시 mutant라 생각하긴 햇지만 T7은 정확하게 일치하고 단지 terminal부분만 안 맞는지.. 정말 T7은 안 맞는건지.. 의문이 드네요. 혹여 양이 부족해서 그런걸까요?
#시퀀스
 
#시퀀싱
 
#sequencing
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
뒷다리1q2w3e4r!  |  2015.09.07   

제가 조금 찾아봤는데 아무래도 앞에서는 제대로 읽히는게 뒤에서 제대로 안 읽히면

접혀서 그렇다고도 하는데 정말 그럴 가능성이 높은걸까요? 콜로니를 mix해서 따고 그러지는 않는데..

플라스미드가 원형이긴하나 폴딩 때문에 프라이머가 제대로 binding이 안 되어 뒷부분에서 읽으면 제대로 안나온다면

직접 프라이머를 제작해서 시퀀싱을 보내면 확실히 알 수가 있을까요?

이런 경우는 처음이라..

개구리Agar  |  2015.09.09   
그냥 진행 하셔도 무방 합니다

경험상 문제 됐던적은 없는거 같네요 ㅎ
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