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질문 siRNA 실험 문의드려요~
올챙이siRNA  |  2015.08.22 15:03
siRNA 처리 후, 보통 knock down을 western blot으로 보는데요,
저는 pcr과 qPCR로 확인하라고 하셔서 ,cell을 긁어 RNA, DNA합성하고,
군을 control, si control-A, si target gene (n=3) 으로 나눠서 qPCR 결과를 봤더니,,
n=3 결과가 각각 달라요;;;;;;

1. 이런 결과를 어떻게 해석해야 하는지 의문이구요,,
2. 외산siRNA가 잘 감소된다고 해서 시약 기다리는데, 몇달 소요됐거든요; 아예 시약을 국산 바이오니아에서 다시 주문해서 처음부터 다시 실험을 해볼까 생각도 들구요,,
3. pcr로 knock down 하는것 보다, western blot으로 확인하는게 더 나은가.. 생각이 들어서,, anti body를 구매해서 실험하는것이 나을까요?









#siRNA
 
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
지니가다가...  |  2015.08.24    
저희는 실험을 어떻게 하냐면....

실험을 3개의 well에서 나온 sample을 전부 합쳐 잘 섞어준 후 실험 합니다.
이 실험을 3번 반복하는데요..

이렇게 하는 이유는 transfection efficiency가 well간 달라질 수 있기 때문에 그러는거구요

이런식으로 해서 sample 조건당 비교를 하시는거구요.. well간 비교가 아니잖아요..^^

당연히 달라질 수 있으니.. 한번 실험하실 때 well 마다 얻은 건 전부 합쳐서 실험하시고..

이런 실험을 3번 반복하셔서 패턴의 유사성을 보시면 됩니다.
개구리G.P.Ts  |  2015.08.26   

real time PCR은 감도가 좋은 것으로 알고 있습니다.
그 만큼 파이펫팅 변수가 작용할 수 있습니다.
혹은 siRNA 효과가 적기 때문일 수도 있습니다.
말씀하신대로 웨스턴 블랏이 좀 더 확실할 것으로 생각합니다.
물론 이 실험 역시 실험 차이가 있지만, 발현 자체가 대조군보다 반 이상 떨어지지 않을 경우 해당 siRNA를 쓰지 않는 게 좋은 것으로 알고 있습니다.
siRNA 농도 및 시간별로 처리한 후 상기 실험을 다시 해 보시길 권합니다~

도움이 되길 바랍니다~

지나가며..  |  2015.09.03    
일단sample을 prep한 시점은 siRNA을 처리하고 얼마나 지났는지요?
siRNA는 최대 72시간이라고하는데.. 대략 48시간내에 하셔야 합니다.
그리고, 제각각 일수도 있습니다. cell이 siRNA를 잘 안먹는 경우 비일비재해요.

그리고 웨스턴으로 한다고 별로 달라지는건 없습니다.
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