실험 Q&A Mol. Biol.-RNA > etc.
shRNA 제조할때 문제가 발생해서 문의드립니다..ㅠ
뀨.. (비회원)
shRNA construct 제조중인데 이게 합성이 잘 안되네요..
일단 제가 가진 문제점에 대해 설명드리기에 앞서,,
shRNA 디자인 후 올리고 주문을 하여 annealing 시킵니다.
(이때 프로토콜대로 95도, 72도 37도 25도 4도 요래 쭉 반응 시킵니다)
그리고 붙여진 친구들을 expression vector에 넣고 (clontech vector)
transformation 하여 colony를 따서 DNA prep. 하여 sequencing을 보냇습니다
그런데 여기서 sequence가 제대로 맞지 않는 불상사가 계속 발생합니다...
full sequence에서 (oligo sequence)이상하게 한자리 혹은 여러군대 곳곳에 빈 공간이 발생합니다. (ex. ATGAGATGCGCCGTA ATCGCGTGCCGACT <--- 중간에 비는 곳 발생)
(첨부 파일 참조...)
이게 여러 colony에서 동일한 곳에서 빈다면 oligo가 잘못되었다고 볼수 잇지만
동일한 곳이 아닌 군대군대 띄엄띄엄 다른곳의 서열이 비는 현상이 자꾸 나타납니다...
full sequence가 제대로 합성이 안되었으면 sh 기능이 안되는거 아닌가요???
제대로된 shRNA construct를 만들려면..ㅠㅠ
빨리 합성해서 얘가 knockdown 시키는지 빨리 확인해야 될텐데 그거조차 못하고 있으니..
많은 조언 부탁드립니다,,
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