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 전체 > Molecular Biology-DNA > Sequencing
조회 1720  스크랩 인쇄하기 주소복사 트위터 공유 페이스북 공유 
질문 ligation이후 시퀀싱을 보냈는데 끝부분이 안맞네요
올챙이attom  |  2015.06.18 12:03
1473bp짜리 insert를 넣었고
ligation 된 후 enzyme 쳐서 size 맞게 잘리는것도 확인했습니다
그런데 시퀀싱 결과가 앞부분 70bp 정도 뒷부분 30bp 정도가 안맞네요;;
다른 부분은 전부 맞습니다

시퀀싱 프라이머가 원래 pcr할때 썼던 것인데.. 너무 끝쪽은 잘 안읽혀서 그러는 걸까요?
pcr상의 오류는 아닌게, t-vec에 넣고 시퀀싱 확인 잘 했고
지금 쓰는 벡터로 옮긴 뒤의 시퀀싱이 안맞는 거라서요 ㅠㅠ 
예전에 다른 insert를 같은 벡터에 넣었을때도
pcr에 사용한 프라이머로 잘 시퀀싱 했어서..
좀 당황스럽네요

도움부탁드려요 ㅠㅠ 서둘러 진행해야 하는데 된건지 안된건지
잘못됨 뭐가 잘못된건지 몰라서 방황중이네요,,
#sequencing
 
#DNA
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
개구리닥님  |  2015.06.18   
이전에 Ab님께서 비슷한 질문을 주셔서 그거 링크해 드리고 답변 복사해드립니다.
http://www.ibric.org/myboard/read.php?id=484389&Board=exp_qna

------------------------
1. sequencing도 PCR처럼 비슷한 원리로 된다고 보시면 됩니다. sequencing 결과로 text파일 말고 chromatogram도 있으실텐데요.. 대게 보통 10~50 정도 많게는 100bp 부분까지는 밑에 그림처럼sequencing chromatogram이 sharp 하지 않습니다.upload image

chromatogram을 보시고 sharp 한 부분부터 신뢰있게 보시면 됩니다.
upload image
그리하여 PCR때 사용한 primer 보다 주로 앞쪽 primer로 sequencing을 의뢰합니다.
올챙이attom  |  2015.06.18   
답변 감사합니다

말씀하신 이유가 맞는거 같습니다.
이 vector는 universal primer도 없고...
기존에 사용하던 사람들도 그냥 pcr primer로 시퀀싱을 진행했고 큰 문제가 없었거든요 ㅠㅠ
벡터 시퀀스를 찾아서 primer를 다시 짜야겠네요
ligation은 잘 되었을 확률이 높은거 같구요.
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