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질문 real time pcr시 ct값 문제
올챙이초보석사생  |  2015.05.21 18:22
최근 real time PCR을 처음 실험하고 있습니다.
real time PCR을 하면서 문제가 되고 있는 것이 target primer의 ct값이 안나온다는 것입니다.
easy-RNA prep kit로 cell에서 RNA를 추출하고 나노드랍으로 RNA 농도를 측정해서
cDNA 합성 키트로 cDNA를 합성합니다.
그리고 primer와 SYBR mixture를 만들고, cDNA와 depc-water를 섞어 mixture를 만듭니다.
PCR plate에 primer mixture를 먼저 넣고 DNA mixture를 넣은 후에 필름을 sealing한 후 real time PCR을 돌리는데요.
결과를 보면 GAPDH의 ct값은 나오는데 target primer의 ct값은 안나옵니다.
(모든 sample에서 GAPDH의 값은 22~23 정도 나옵니다)
전체적으로 안나오는것이 아니고 control에서만 안나옵니다.
약물을 친 sample에서는 ct값이 나오는데 control에서 안나오니 상대정량을 할 수가 없어져버립니다.
cDNA 합성이 잘못 됐나 싶어 RNA prep을 다시 cDNA로 합성하여 해봤는데도 똑같이 GAPDH값만 나오고 target primer에서는 안나옵니다.
mixture의 오염이라기엔 다른 sample에서 값이 나오기 때문에 아닌것 같고
cDNA 오염이기엔 또 GAPDH에서 ct값이 나오니 아닌것 같고 문제점을 모르겠어요ㅠㅠ
하나 걸리는 것은 RNA 농도를 잴 때 농도와 purity가 낮았던 것인데 GAPDH 값이 나오는 것 보면
RNA prep 문제도 아니라고 생각하고 있습니다. (전체적으로 sample의 RNA 농도가 낮았습니다)
PCR 조건과 primer는 전에 썼던 것과 동일한 것으로 전에는 실험 결과가 잘 나왔던 것들입니다.
제가 생각지 않은 문제점이 무엇인지 고수님들이 알려주세요ㅠㅠㅠ
#real time PCR
 
#CT
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
꽃개구리느림보  |  2015.05.22   
Control에서 해당 유전자가 발현되지 않았을 가능성을 검토하셨는지?
분모가 0 이 되는 문제는 콘트롤을 분자로 돌려서 표현하면 됩니다.즉 실험군을 reference로 대치하는 겁니다.
리얼리얼  |  2015.05.22    
똑같은 세포에 약물을 쳐서 target 유전자의 증가 혹은 감소를 보는 것이기 때문에 
실험하는 세포주에서 endogenous expression level을 기본적으로 체크하셔야 합니다. 
약을 쳤을 때 Ct 값이 나온다는 것으로 봐서 endogenous level은 낮고 
약에 의해서 그 유전자의 전사가 증가하는 것을 보고 싶은가 봅니다. 
endogenous level이 더 좋은 세포에서 다시 실험해 보는 것도 한 방법입니다. 
하지만 이렇게 백그라운드가 강하면 gain of function을 보는 것이 더 어려울 수도 있어요.

그런데, 의문이 드는 것은 GAPDH의 Ct값이 너무 낮아 보인다는 것입니다. 
GAPDH는 glucose를 이용해서 대사하는 세포라면 무척 abundant 하게 발현하는 유전자 입니다. 
GAPDH의 Ct 값이 22~3인 것은 무척 낮은 레벨로 보입니다. 
역전사를 다른 좋은 엔자임으로 다시 해보세요. 
리얼타임에서 가장 중요한 요소는 RNA의 퀄리티와 훌륭한 역전사 입니다. 
두 가지가 동시에 충족되지 않으면 똥밭에서 금을 찾는 것과 다름 없습니다. 

그 다음으로 체크할 것이 프라이머의 유효성입니다. 
멜트커브 체크하시고 프라이머 블라스트 들어가서 센시티비티 체크해 보세요. 
엑손정션을 스팬 하는 프라이머로 새로 디자인해보시구요
프로덕트 사이즈도 120bp 이하로 짧게 디자인해보세요.
가능하다면 저는 80bp전후의 프로덕트 사이즈를 추천합니다. 

그리고 또 체크 할 것은 검증하고자 하는 유전자를 RNA level에서 
체크하는 것이 논리적으로 타당한지 검증하는 것입니다. 
protein stability 혹은 location, phosphrylation이 중요한 유전자는 아닌지?

데이터 들고가서 지도교수님께 적극적으로 여쭤보세요. 






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