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 전체 > Cell Biology > Cell Culture
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질문 sphere 형성된 cell에서 qRT PCR이 안됩니다.
초보자  | 2015.05.20 12:29
답변있는 질문은 수정/삭제 불가(☞문의)
안녕하세요 sphere culture를 하게 된지 6개월이 되었는데 결과가 없어서 이렇게 올려봅니다.

문제는 sphere cell로 자란 HCT116,, HT-29와 플레이트에서 부착되어서 자라는 HCT116, HT29 세포를 모아서 qRT-PCR을 하면 CD 44, 133, SHH, Sox2, nanog의 발현이 sphere그룹에서 오히려 감소되어 있습니다. ㅜㅅ ㅜ
교수님께서는 sphere사진으로 보았을 때 형성은 제대로 된것 같다고 하십니다.
무엇이 잘못된 것일까요?

그리고 sphere culture를 진행할 때 나중에 사용할 약물에 대한 control로 EtOH, DMSO를 첨가한 그룹도 있는데, DMSO, EtOH처리군과 처리하지 않는 sphere에서의 qRT결과를 보면 DMSO, EtOH처리군에서 SHH, SOX2, nanog의 변화가 심하게 나타납니다.
이 예비실험때문에 본 실험을 하지 못하고 있는 상황입니다.


프로토콜은
1. ultra-low attachment 플레이트에 세포를 1~10*10^3/ml로 시딩하고 이때 사용하는 배지에는
0.5% BSA, 0.5% FBS, p/s, insulin, LIF, EGF, FGF를 넣고 3-4일 키운뒤 배지 1ml (+insulin, FGF, EGF, LIF)을 첨가후 3일후 harvest 합니다.
2. harvest할때 1ml 파이펫으로 5번이상 파이펫팅을 해보아도 형성된 sphere는 깨지지 않습니다.
#sphere cell
 
#qRTPCR
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
엉뚱이  |  2015.05.22    
sphere배양하신 세포를 뽀게서 RNA를 뽑는게 생각보다 쉽지않지요??
잘 안뽀게 질꺼예요~2-mercapto?! 맞나 암튼 최대한 잘 뽀게야 합니다.
그리고 보시는 SOX2 나 Nanog유전자는 생각보다 유전자 발현양상이 엄청 다양합니다.
음...치고 빠지는게 빠르고, 유전자 발현양이 적어서 더욱 그 발현차이가 크게 데이타로 나옵니다.
일단 셀을 잘뽀게서 동일한 퀄리티의 RNA를 뽑으셔야 할 듯....
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