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 전체 > Molecular Biology-DNA > Sequencing
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질문 sequencing을 위한 PCR product 농도
알Lab노예  |  2015.04.20 10:54

일정한 유전자 염기서열을 확인하기 위해 sequencing을 보냈습니다. 근데 결과가....ㅠㅠ

이게 pcr 후에 사이즈 확인할 때는 두껍고 진해서 괜찮은듯 한데 purify만 하면 농도가 너무 낮아지는 것 같습니다.

나노드랍으로 측정하면 거의 10ng/ul 내외로 나옵니다. 일반적으로 35cycle을 하는데


이러면 purify가 문제인건가요.... 아니면 PCR cycle 수를 좀더 늘려야될까요?
#sequencing
 
#PCR
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올챙이아예  |  2015.04.20   

PCR purification 하면 농도가 워낙 좀 줄긴 하더군요.  시퀀싱 하는데는 소량만 필요하실테니 큰 문제는 없을 것 같습니다. 아닌가요?  PCR cycle을 늘리기보다는 Purify 방법을 spin kit를 사용하신다면 gel extraction kit 로 하시던지 방법을 바꿔보시길~

개구리szzang  |  2015.04.20   
35cycle에서 더 늘린다는 건 의미가 없죠... 충분히 많이 돌리신거 같구요...

그리고 충분히 진하게 밴드가 나왔고 농도도 어느정도 됐다면, PCR 밴드 사이즈가 100bp이하로 작지만 않다면, 일반적인 spin column type kit으로 Purify했을 경우 수율이 80% 이상 그리고 사이즈가 작은경우 isopropanol을 1volume넣어주고, 정제하면 어느정도 수율은 나옮니다.

PCR volume을 50ul 정도로하시면, 충분한 양을 얻고도 남죠...

아무래도 다른 문제가 없다면 purify 문제겠죠...
알cheols  |  2015.04.20   
시퀀싱 업체 문제일수도.....ㅋ
정제 산물도 전기영동해서 확인해보셨나요?
알Lab노예  |  2015.04.20   
다들 감사합니다.... 정제 한 것을 다시 전기영동해보진 않았습니다. 이건 필히 해봐야되는데 수급량이 적을거라 예상해서 nanodrop만 측정했었습니다...만 그래도 업체측에서 요구한 양보다 낮았습니다.

purify 할 때는 spin column을 사용하는 kit를 사용합니다. 단지 PCR을 할 때, 20ul를 거의 기준으로 진행하기 때문에.... 답변 감사합니다. 유의해서 진행해보겠습니다!

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