실험 Q&A Cell Biology > Transfection
luciferase assay 고수님들~~~
신입생 (비회원)
제가 luciferase assay 를 하고 있습니다. 할때마다 완전 좌절을 합니다. 님들은 luciferase assay 할때 DNA를 어떠한 방식으로 넣으시나요? 전 midi prep으로 뽑은 DNA를 사용합니다. 농도가 대충 0.50ug/ul인 DNA를 사용합니다. 제가 6well plate에 DNA양에 따른 변화를 측정을 합니다. DNA를 0.5ug에서 절반씩 줄여가면서 0.03...ug까지 넣어주고 있습니다. 처음 0.5ug은 1ul를 따면 되지만 0.03ug은 거의 따기가 힘이 듭니다. 그래서 생각을 한것이 transfection 할때쓰는 serum free media 100ul에 5ug 이 되게 넣어서 이것을 1/10 을 사용합니다. 처음에 100ul중에 20ul을 따서 0.5ug으로 10ul를 사용하고 남은 10ul에 serum free media 10ul를 넣어서 이중 10ul를 따서0.25ug으로 사용을 합니다. 이런식으로 0.03...ug까지 dilution을 해서 넣어주고 있습니다. reporter gene은 한 well당 들어가는 양에 총 well수를 곱해서 한꺼번에 섞어서 각 tube에 양에 맞게넣어줍니다. 여기에 위의 dilution방식으로 DNA를 섞어 줍니다. 그래서 제가 사용하는 DNA양은 1.7ug/well 이렇게 됩니다. 이게 이게 적당한 양인지도 궁금합니다. 혹시 뭐가 잘못된것이 있나요? 교수님 말로는 1ul를 따는것보단 차라리 10ul를 따는게 DNA양의 오차를 줄일 수 있다고 하거든요.... 그리고 lysis 과정은 lysis buffer를 넣어주고 scrapper로 긁어 모은다음 센돌이 돌리고 sup만 사용을 합니다. assay 할때 20ul씩 사용합니다. luciferase buffer는 promega걸 사서 쓰고 이건 50ul씩 넣어주고 값을 측정을 합니다. cell lysis 할때여 직접 lysis buffer를 넣지 말고 washing후에 trpysin을 처리하여 cell을 모은 다음에 lysis를 해도 되나요? 나와야 할게 않나오니까 완전 좌절 중입니다. cell 양은 well당 동일하게 seeding하고 있습니다. 그리고 transfection 후에 media change 해주고 incubation시에 well에 cell이 100% 찰 경우에 80~90% 찰 경우보다 assay 할때 측정값에 영향을 주나요? 전 50~60% cell이 찰 경우에 transfection을 합니다.이렇게 해도 transfectiong 후 24시간이면 cell 이 꽉 차있습니다.처음에 너무 cell이 적게 seeding 되어도 transfection효율이 안좋다고 하던데요..... cell이 어느정도 일때 assay를 해야 좋을까요? 다른 사람 이야기 들어보면 최소 24시간 뒤에 assay를 해야 한다고 해서.... 24시간 이전에 18~20시간이면 꽉 차버립니다. 제발 제발 좀 도와주삼~~~~~~~~~~~~~~~ 지금 완전 좌절중 입니다. 해야할 실험도 많은데 손에 잡히질 않습니다. luciferase assay 고수님들 제발 제발 도와주삼~~~~~~~~~~~~~~~~~~ 모두모두 좋은 실험 데이터 내서 publish 하시길......
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