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 전체 > Molecular Biology-Protein > Western Blot Analysis
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질문 Western blot 실험 후 background가 검정색으로 나옵니다~
western  | 2015.01.02 09:24
 답변있는 질문은 수정/삭제 불가(☞문의)
첨부파일 파일첨부: Western.jpg (60 KB)
이미지 첨부파일
Western blot을 처음 실험하는 학생입니다.

실험 후 detection은 암실에서 진행하고 있는데요. detection하면 membrane 부분이 검정색으로 나옵니다.

밴드는 검출되지 않지만 1차 항체 농도를 바꿔봐야 할 것 같아요~

왜 배경이 검정색으로 나오느지를 모르겠습니다ㅠ

blocking solution은 5%skimmed milk(TBST)로 상온에서 30분 반응시킵니다.

그리고 항체는 TBST로 희석하는데요. 혹시 blocking solution으로 희석해야 하나요~

답변 부탁드립니다.
#western blot
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
개구리미완의꿈  |  2015.01.02   

1차 2차항체 모두 blocking solution 에 넣으시구요
blocking time도 늘려보세요.

그다음에 antibody dilution 비율도 높여보시구요
western  |  2015.01.02    

넵, 감사합니다

1차 항체는 1 :10000배로 희석해서 사용하였고, 2차 항체는 1 : 1000배로 희석한 후 사용하였습

니다~ 그리고 항체 반응시킬때 27도씨에서 교반배양기를 사용하여 반응 시켰는데요~

4도씨에서 반응시켜야 하나요??
H  |  2015.01.02    
1차 2차 항체 희석비율이 바뀐거 같은데요
그 비율이면 보통 1차를 1:1000, 2차를 1:10000으로 하죠~
그리고 1차붙일때 오버나잇으로 할꺼면 4도씨에서 천천히 붙이시고
당일에 바로 2차까지 보실려면 RT에서 붙이세요~
워싱과정은 교반속도도 높여서 깔끔히 워싱되도록 하시고..
blocking만 잘 되면 1차 2차는 그냥 TBS-T에 하셔도 괜찮습니다.
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