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 전체 > Molecular Biology-DNA > Purification/Isolation
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질문 gel purification에 대한 질문
알pjh144910  | 2014.11.05 18:11
첨부파일 파일첨부: 2014-11-05-18-01-12_deco.jpg (744 KB)
이미지 첨부파일
균으로부터 genomic DNA를 extraction하고 DNA를 PCR 30cycle한후 전기영동을 걸었을 때 잡DNA, smear현상이 있어 gel purification과정을 했습니다.

gel purificcation과정은 아래와 같습니다.

1. PCR product(16s rRNA) agarose gel 전기영동(30분)
2. agarose gel 상에서 target band cutting 후 1.5튜브에 넣는다.
3, GB buffer 500마이크로리터 넣은 후 56도 10분 incubation
4. Mixture를 spon column에 옮긴 후 8000rpm/1분 centrifuge
5. collection tube 비우고 GB 300마이크로리터 넣고 8000rpm/1분 centrifuge
6. collection tube 비우고 NW buffer 700마이크로리터 넣고 13,200rpm/1분 centrifuge
7. 공회전 13,200rpm/2분
8. column을 새튜브에 옮기고 멸균 3차 증류수 20마이크로리터 넣고 1분 대기
9. 13,200rpm/1분
10. agarose gel 상에서 elution band 최종확인

사진의 위는 purification하기 전의 전기영동 결과이고, 밑에 사진은 purification이후의 전기영동 결과입니다.
사진으로 봤을 때 purification하고 난이후의 밴드가 확실히 전보다 희미해지고, band가 거의 보이지 않는 경우도 있는 데, 이는 왜 이런 결과가 나오는 건가요??

그리고 이 이후에 ligation을 할 건데 band가 희미하면 이 다음 실험결과에 어떤 문제가 생기나요??

동일한 실험방법으로 다 했는데, 각 lane마다 band의 선명도에 왜 저렇게 차이가 나나요?

(실험결과에서 각 lane은 E.coli, P.haeundaensis/E.coli, P.haeundaensis/E.coli, P.haeundaensis/E.coli, P.haeundaensis 순 입니다.)

구체적인 답변 기다리겠습니다!
#gel purification
 
#band
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
 |  2014.11.05    
GB buffer가 어느제품인지는 모르겠습니다만 agarose gel extraction buffer는 보통 젤 무게의 3~4배정도 넣는다고 알고있습니다. 그리고 GB buffer  두껑입구에 salt가 많이 있었다면, 새제품을 사용하세요. 이유는 자세히 설명하지 않겠습니다...원리를 아시면...isopropanol을 젤 무게 만큼 첨가하시면 더 수율이 좋을 겁니다.

그리고, 컬림 로딩하시고 왜 다시 버퍼를 넣는지 의문이네요. 보통 로딩하고 FT버리면, 70~80% EtOH 600 ul로 한번 washing하고,  따뜻한 (~50 oC) UPW 30~50 uL로 elution 받으면

대략 50 %정도의 loss와 함께 DNA를 확보하실수 있을 겁니다.
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