실험 Q&A Mol. Biol.-DNA > DNA Modification
코스모진택님-pfu pcr 결과
@@ (비회원)
일전 pfu 폴리머레이즈에 대한 질문에 답변주셨습니다. 일반 늘 해오던 방법처럼 1st PCR로 앞 프래그먼드 , 뒤 프래그먼드밴드얻어 일루션, 각각 프라덕트를 템플래이트로 하여 2nd PCR하여 젤런... 이런 방법으로는 뮤탄트 클로닝이 힘들어 PFU polymerase로 시도해봤습니다. 10.6kb (벡터:4.7kb+insult:6kb)이상태로 서브클로닝되어있는 template를 point mutation시키려고 타겟뮤테이션 부위에 aa바꾸어 디자인한 F,R primer넣고 pfu PCR했습니다. 50ul reaction volume중 일부 젤런했더니 10.6kb에 밴드가 보여 피시알됫거니 했습니다. PFU경우 피시알 산물중 일부를 바로 컴셀과 트랜스포메이션하여 젤런하거나 엔자임사이트 달아 디자인할 필요가없다고 알고 있습니다. 콜로니 확인되어 원래백터와 인설트 라이게이션되어있는 제한효소로 더블컷 했더니 6과 4.7kb로 보였습니다 dna 프랩해서 시퀀스 맞겼는데 포인트뮤테이션부위에 모두 뮤테이션이 안되었습니다 이를 어찌 해석해야할지요? 피시알이 안된것인지... 그리고 귀사이트인가요 무료로 taq 샘플 주신다는거 읽은거 같은데 혹시 10kb이상에 사용할만한 taq인지요? 이것사용법이 피시알후 젤런해서 타겟밴드 오려내어 엔자임자르고.... 아니면 pfu처럼 피시알 후 바로 트랜스포메이션하는 것인지요? 조언주시면 많은 도움이 되겠습니다.
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