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 전체 > Molecular Biology-DNA > DNA Modification
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질문 코스모진택님-pfu pcr 결과
@@  | 2007.10.15 09:17
답변있는 질문은 수정/삭제 불가(☞문의)
일전 pfu 폴리머레이즈에 대한 질문에 답변주셨습니다.
일반 늘 해오던 방법처럼 1st PCR로 앞 프래그먼드 , 뒤 프래그먼드밴드얻어 일루션,
각각 프라덕트를 템플래이트로 하여 2nd PCR하여 젤런...
이런 방법으로는 뮤탄트 클로닝이 힘들어 PFU polymerase로 시도해봤습니다.

10.6kb (벡터:4.7kb+insult:6kb)이상태로 서브클로닝되어있는 template를 point mutation시키려고 타겟뮤테이션 부위에
aa바꾸어 디자인한 F,R primer넣고 pfu PCR했습니다.
50ul reaction volume중 일부 젤런했더니 10.6kb에 밴드가 보여 피시알됫거니 했습니다.

PFU경우 피시알 산물중 일부를 바로 컴셀과 트랜스포메이션하여 젤런하거나 엔자임사이트 달아 디자인할 필요가없다고 알고 있습니다.

콜로니 확인되어 원래백터와 인설트 라이게이션되어있는 제한효소로 더블컷 했더니
6과 4.7kb로 보였습니다
dna 프랩해서 시퀀스 맞겼는데 포인트뮤테이션부위에 모두 뮤테이션이 안되었습니다

이를 어찌 해석해야할지요? 피시알이 안된것인지...
그리고 귀사이트인가요 무료로 taq 샘플 주신다는거 읽은거 같은데 혹시 10kb이상에
사용할만한 taq인지요?
이것사용법이 피시알후 젤런해서 타겟밴드 오려내어 엔자임자르고....
아니면 pfu처럼 피시알 후 바로 트랜스포메이션하는 것인지요?

조언주시면 많은 도움이 되겠습니다.

#pfu pcr결과
답변하기
답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
앞다리코스모진텍  |  2007.10.15   
우선 10.6kb에서 밴드가 보였다고 하셨는데, 사실 밴드가 보이지 않습니다.
밴드가 보이는 이유는 pcr을 하실 때, template양을 많이 넣으셨거나,
pcr을 18cycles 보다 더 많이 돌리셔서 그럴겁니다.
그리고, site directed mutagenesis 과정에서는 pcr product에
dpn enzyme 처리를 하셔야 합니다. 선생님께서 제한효소로 확인 했을때의 결과가
좋게 나왔지만, mutation이 안된것은 원래의 벡터 자체가 transformation된 것이라
추측됩니다.
참고로 10kb 이상도 가능합니다.

다시 정리하면, 선생님께서 원하시는 결과는 벡터와 inset가 삽입된 벡터의 한 부분을
(1bp ~ 6bp) point mutation하실려고 하는거라 생각됩니다.
이 방법을 site directed mutagenesis라고 합니다.

우선, 두가지 방법이 있습니다.
첫번째로 동일한 site에 primer F와 R을 제작하여 18cycles로 pcr하신후,
pcr purification을 하시고, 그 다음 dpn 처리를 하셔서, 본래의 template(=벡터)
를 파괴하셔야 합니다. 그런다음 transformation 하시면 됩니다.
pcr하실때는 pfu만을 사용하시기 바랍니다.

두번째 방법은 다른 site에 primer F와 R을 제작하여 pcr(30~35cycles)을 하시는
겁니다. primer를 제작할 때는 양 쪽에 변환시키고 싶은 부분을 넣어야 합니다.
이때 기존의 있는 벡터의 염기는 임의로 넣는 염기수 만큼 빼줘야 하구요.
전기영동으로 pcr이 잘 되었는지 확인하시고, 됐다면 gel extraction을 하시고,
t4 polynucleotide kinase 처리를 하신 후, ligation후 transformation 하시면 됩니다. 아참! pcr하실때는 반드시 pfu를 사용하셔야 합니다.
왜냐면, 말단에 a가 있으면 안되니깐요.(이야기가 길어질듯하고, 글을 쓰다보니 오해의 소지가 생길수 있기 때문에 전화를 주시면 자세히 설명해드리겠습니다.)

저희 pfu 샘플을 써보실 생각 있으시면 연락처를 알려주세요^^
광고하는거 같은데
저희 회사 cloning 서비스를 이용하시면 시간 및 비용을 절감하실수도 있겠네요.^^
@@  |  2007.10.17    
코스모진택님
자세한 설명 진심으로 감사드립니다.
좀 더 검토해본 뒤 궁금한 점이나 도움이 필요하면 연락드리겠습니다.
답변하기
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