yeast 표면발현 라이브러리 제작중인 석사생입니다. linear vector transformation을 통해 원하는 10^6개이상의 원하는 colony를 얻었습니다.
발현 조건을 잡기위해 circular 형태의 vector와 linear형태의 벡터를 따로 트랜스포메이션했는데 콜로니pcr로 확인시 circular vector 삽입된 콜로니는 일반 콜로니 pcr로도 깔끔한 밴드를 얻을수 있었는데 linear벡터 트랜스포메이션한 콜로니는 NaOH와 열로 깨고 나서야 겨우 희미한 밴드를 얻을수 있었습니다. 어떨때는 pcr이 잘 안되고요ㅜ 제가 yeast 관련 지식이 부족하지만 알고있는바로는 yeast colony PCR시 product가 plasmid 상으로 존재할때는 template 노출이 어렵지않아 pcr이 쉽게 되지만 chromosome 상에 존재시 chromosome노출이 쉽지가 않아서 pcr이 어렵다고 들었는데 그럼 linear vector로 transformation된 콜로니는 vector가 chromosome상으로 끼여 들어간건가요? 아님 제가 잘못생각하고있는건지 판단이 서질 않네요 ㅜ 현재 library제작이 목적이라 많은수의 콜로니를 띄우는게 관건이라 앞으로 linear vector transformation 시에 homologous recombination 를 이용하기 위해 repeat module도 벡터 양말단에 삽입하려고 계획중에 있습니다. 이 방법 사용시에도 linear벡터가 chromosome상에 삽입되는걸로 알고있는데 이때 pcr을 보다 깔끔한 밴드를 띄울수 있는 방법 없을까요?
참고로 라이브러리 전체 다 스크리닝 할필요는 없고 20개정도만선별적으로 확인 할 생각입니다. 그후 high throughput으로 넘길생각입니다. 답변 부탁드립니다.