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 전체 > Molecular Biology-DNA > Sequencing
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질문 시퀀싱 결과 오류
알궁그미  | 2014.08.23 21:09
subcloning을 하여 시퀀싱을 맡겼습니다.

처음에 미니프렙하여 맡겼는데 반응이 안 됨, 노이즈 현상, double peak 현상 등 재 반응을 해도 읽히지 않았습니다. 시퀀싱을 한 것인가 의심스러울 정도로 plasmid 6개에 대해 제대로 된 시퀀싱 결과를 받지 못 했습니다.

그래서 이번에는 Maxi prep을 하여 전기영동 확인과 restriction enzyme으로 cutting하여 모두 확인한 후에 시퀀싱을 맡겼습니다. 지난 번에 맡겼던 6개 외에 같은 유전자를 코딩하고 있고 기존에 이미 시퀀싱 했던 plasmid 2개까지 같이 의뢰하였습니다. 그런데 8개 plasmid 모두 또 반응 안됨, 노이즈 현상, double peak 현상, dye blob 양상 등의 이유로 재 반응을 하여 보내겠다고 합니다.

primer를 새로 제작해 보내라, 새로 재주문의 멘트가 있어서 일부러 새로 제작한 프라이머도 보냈고 maxi prep까지 하고 기존 plasmid까지 보낸 건데요. 정말 제가 subcloning을 잘못한 것인지, 제 plasmid의 상에 문제가 있는 것인가요? 이런 적이 처음이라 답답합니다. 그 시퀀싱 회사의 프라이머로 ATG와 stop codon도 못 읽어 내고 있는 시퀀싱 결과를 보고 제가 잘못했다고 생각해야 되는지 아니면 회사 측에 문제가 있는 것인지. 


제가 어떻게 하면 좋을까요? 조언 부탁드립니다. 
#시퀀싱
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
개구리Kim  |  2014.08.24   
저는 plasmid에서 시퀀싱해야 되는 영역을 포함해서 PCR하고 그 PCR product를 시퀀싱 맡겼습니다.
개구리알  |  2014.08.25    

물론 회사의 QA가 잘못 이루어지고 있을수도 있지요.
하지만 제 경험상 대부분의 경우는 DNA puritiy 문제였습니다

특히 RNAse가 제대로 일을 못한 경우 지저분하게 읽히더군요.

mini prep을 다시 해보시고 RNase 만 주변것을 얻든지 새로 사든지 해서 넣어보세요
lysis buffer에 함께 넣어도 되고 elution 후에 넣어도 됩니다

알궁그미  |  2014.08.27   
같은 template에서 같은 restriction enzyme linker를 달아 PCR로 insert를 증폭시켜서 다른 vector에 삽입하였는데, 시퀀싱 결과가 너무 제각기 입니다. 위 선생님 두 분께서 추천해 주신 대로 일단 PCR 증폭 또는 RNase 처리를 통해서 purification 하여 다시 진행해 볼까 합니다. 또한 plasmid의 구조가 문제가 될 수 있다는 회사의 코멘트도 있어 mini-prep을 다시 하여 시퀀싱을 시행하려고 합니다. 

순차적으로 진행해 보고 제 결과 공유하도록 하겠습니다. 고맙습니다.


꽃개구리핵산  |  2014.08.28   
회사를 바꾸니 간단히 해결되었던 경험이 있습니다.
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