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percoll gradient 관련 질문입니다.
ㅠㅠ (비회원)
blood 에서 neutrophil 을 percoll 로 분리해내는 실험을 셋팅하고 있는데요. 처음 접해보는 실험이라 문제가 해결되지 않아 조언을 구하고자 합니다..
neutrophil 의 density 가 1.08~1.10g/ml 로 알고있으며 percoll 을 50% 70% 80% 3개를 만들어 각 3ml 씩 순차적으로 넣은 후 cell sup 을 1ml 넣고 ultracentrifuge 시켰습니다.
후에 neutrophil 이 있다고 생각되는 층을 따서 centrifuge 돌리면.. pellet 이 보이지 않습니다.. 혹시나 소량이라 생각되어 현미경으로 관찰해도 아무것도 보이질 않는것을 보아 제가 ultracentrifuge 후 잘못된 층을 따는것 같은데 논문에서 명시한 층을 제가 잘못 이해하고 있는것 같습니다.
[질문]
1. 제가 percoll 를 60%를 뺀 50% 70% 80% 로 사용했는데 혹시 60%로도 함께 해줘야하는 건가요? 혹시 52%, 78% percoll 을 사용하라고 하면 50%, 80% percoll 이 아닌 꼭 52%, 78% 을 만들어 사용해야 하나요..?
2. percoll centrifuge 후 어떤 논문에서는 70% 80% 의 경계면을 따라고 하고..어떤 논문에서는 중간의 불투명한 층을 따라고 하는데..둘다 percoll 용액 사이의 경계면을 지칭하는거라 생각하여 70%와 80%의 경계면 부근을 get 했습니다. 혹시 percoll 을 사용할땐 경계면을 따는게 아니라 경계면 위나 아래층을 따야하는 건가요..?
percoll 이 투명해서 층 분간이 되지 않을 것 같아 50%와 80%를 만들때는 media 를 써서 붉게 만들었고 70% 은 PBS를 사용하여 만들었습니다.
혹시 제가 잘못된 방법으로 실험을 진행하고 있는지 조언 부탁드립니다.
감사합니다.
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