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 전체 > Molecular Biology-DNA > Sequencing
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질문 식물 DNA 추출시 미생물 오염 제거 어떻게 하시나요?
알생명과학짱짱맨  |  2014.07.25 18:01

다른식물로 각각 1번씩 2번 ITS 시퀀싱했는데
두번 모두 Aureobasidium pullulans 가 동정되어서 질문드립니다.
2번째 실험에선 정말 공들여서 알콜 소독후 진행하였는데도 결과가 이렇고요.
어째서 실험 스텝 2번째인 PCR할 때 식물의 DNA는 증폭되지 않았는가가 궁금합니다.
만약 증폭되었다 하더라도, 전기영동상에서 미생물과 비슷한 bp에 위치하는건가요.
그래서 밴드가 1개였던건가요?
미생물 종명 검색해본 결과 실험자의 손같은데서 옮겨갔을것같지는 않아요.
옆면에 널리 있는 효모라네요...

자세한 스텝이고요.

야외 채집 식물 B.

B의 지노믹 DNA 추출
ITS서열 증폭 PCR
전기영동
ITS는 통상 500~1000 bp 이고 밴드는 1개이므로 밴드 따서 DNA 추출 (겔 추출 키트 이용)
TA 클로닝
DH5알파에 넣고 배양
블루화이트 스크리닝
화이트 콜로니 따서 미니프랩 (처음 TA클로닝 된 플라스미드만 추출될 것임)

TA클로닝 벡터 구조상 ITS는 Hindiii와 BamHi 사이이므로
2 제한효소 넣고 커팅

시퀀싱


이 과정인데요

채집식물 B와
채집식물 C에 대해서 (2개는 각각 활엽수, 침엽수)
C는 특히 B결과가 그랬었기에 알콜에 거의 샤워하다시피 세척후 빻은후 진행했는데도...

2번 모두 시퀀싱 결과가
제목에도 있는
검은 누룩 (흑효모) 이 가장 일치하는 서열이라고 n BLAST가 말해줍니다.
2등 유사도 부터는 2개가 판이함

이게 뜻하는 바가 무엇일까요

채집범위의 식물이 흑효모에 광범위하게 오염되어있다는 뜻일까요
실험자의 피부 중 흑효모가 많다는 뜻일까요

분명한것은 과정중 처음 쓰는게 식물DNA추출키트이기 떄문에
애초에 미생물것은 안뽑혀야 맞는거고
뽑혔다 치더라도 식물것과 미생물것이 같이 뽑혀서, PCR 결과가 2밴드형태이든,
그 이후 (식물 1개당 같은실험을 2번 3번 했기때문에) 샘플 중 1개 정도는 맞는 결과가 있어야 하는것 아닌가요?

#미생물
 
#식물
 
#pullulan
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
오호...  |  2014.07.28    
저 학부때 했던 실험과 매우 유사한 실험을 하고 계시네요~
반갑습니다~
먼저 식물 DNA 추출키트를 사용해도 미생물 DNA 뽑히고요~ 잘 소독하고 한다 하더라도 fungi DNA가 증폭이 되더라고요.

먼저 ITS 부위가 nucleic DNA이기 때문에 식물에도 있고 미생물에도 있어서 같이 증폭이 될 확률이 높습니다. bp도 유사하기 때문에 밴드도 거의 붙어있거나 혼합되어져 있는경우가 많더라고요.....
10년전 실험한거라 기억이 가물가물 한데...혹시나 실험의 목적이 sequencing을 통한 identification이라고 하시면 nucleic DNA 부분이 아닌 chloroplast DNA 부위를 증폭하셔서 확인하신다면 좀더 확실하게 ID를 할 수 있을것 같네요~

저같은경우 ITS1-4, trnL-F 두 부위를 sequencing해서 crosscheck 하는 방법으로 ID했던거 같네요~

좋은결과 있으셨으면 좋겠습니다.

계속 미생물 DNA가 증폭되시면 아예 식물체를 다시 채집하셔서 해보시는것도 한 방법일 수 있겠네요.
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