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 전체 > Molecular Biology-DNA > Gene Cloning
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질문 PET302에 K12 ecoli에서 DNA ligase 유전자를 플라스미드를 재조합한 후 밴드확인 결과 이상한 결과가 나왔습니다.
알심야식당  |  2014.07.08 09:15

upload image

위 사진은 PET302와 DNA ligase를 ligation한 후 DH5a에 transformation 한 후

다시 BL21에 넣기 위해 플라스미드를 추출한 하 전기영동한 사진입니다.

맨위에 플라스미드 밴드는 약 8000kb정도 되는것을 확인 하였습니다.

그런데 아래 밝게 있는 밴드가 무엇인지 모르겠습니다.
loading양이 적기 때문에 맨위 밴드가 엄청 흐리고 PET302특성상 플라스미드 수율이 무척 낮습
니다. 그렇기 때문에 플라스미드 밴드 아래 굵게 밝게 나오는 부분이 무엇인지 궁금합니다.

처음에는 RNA인줄 알았습니다. 그래서 RNase a처리를 했는데 밴드가 사라지지 않더군요

그래도 혹시나 해서 BL21에 transformation했더니 콜로니는 생성되었고

콜로니를 키워서 다시 플라스미드프렙을 해보았는데 밴드가 다시 저렇게 나옵니다.

저 환한 밴드가 뭔지 궁금합니다. 그리고 저런 현상을 보여도 단백질이 발현이 되나요?

PS전에 게시판에 질문을 했는데 사진만 보시고 답변해주셔서 다시 적습니다.  
밝은 밴드가 플라스미드가 아닙니다. RNase처리를 했는데 지워지지 않았습니다.

#클로닝
 
#플라스미드
 
#유전자
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리강시  |  2014.07.08   
두껍게 있는 밴두가 플라스미드입니다.
10개 중 2번과 8번이 아마도 insert가 들어간 것일테고 나머지는 그 두개보다 산대적으로 조금 작아보이는것이 아마도 vector 셀프 라이게시션됭것일테지요.
맨 위의 희미한 밴드는 아마도 gDNA가 오염된 것일 가능성도 있습니다.
하지만 2번과 8번 플라스미드의 크기만큼 밴드가 위로 살짝 올라가 있는것이 OC 플라스미드일 가능성도 있어보입니다.
젤의 맨 아래쪽에 퍼져있는 것이 RNA일겁니다.

BL21에 넣기전에 잘라서 확인해 보세요.
인서트와 벡터를 딱 분리할 수 있는 효소로 자르면 젤 좋고 아니면 다른 효소로라도 인서트가 들어가 있는 것을 확인할 수 있는 것으로 잘라서 크기를 확인해 보세요.
자를때는 젤 사진에 보이는 DNA의 1/5 정도만 자르세요. 양이 엄청 많습니다.
알심야식당  |  2014.07.08   

답변 감사합니다.

Pet 302에서 플라스미들 추출하게 되면 수율이 상당히 낮습니다,

그래서 클로닝 실험을 하기 위해 상당히 많은 양을 배양해서 추출했습니다.

위 로딩한 사진은 플라스미드의 존재 유무만을 확인하기 위해 3ml정도에서 추출한 것입니다.

그렇기 때문에 밴드가 저렇게 진하게 나올 리가 없습니다.

실험을 그냥 진행하기는 하였는데 저 밴드가 도대체 무엇인지 너무 궁금해서 이렇게 계속 질문을
드리고 있습니다. ㅠㅠ

대왕개구리강시  |  2014.07.09   
저 두꺼운 밴드는 분명 rRNA는 아닙니다.
시료별로 위치가 차이가 있거든요.
만일 rRNA라면 크기도 비슷하고 그래서 같은 위치에 있을것이며 또 마커(정확히 어떤 마커인지는 모르겠으니) 의 위치와 비교해볼때 rRNA는 한참 아래로 내려와야 하게든요.
결국 효소로 잘라봐야 정체를 알 수 있겠지만 분명 플라스미드일겁니다.
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