실험 Q&A Mol. Biol.-DNA > Southern Blot
급질문 도와주세요..southern용 genomic dna를 뽑아서 enzyme digetion했는데요..
레벨1 좀 나와라
bacterial genomic dna를 페놀:클로로 방법으로 뽑아서 농도를 재고 뽑은 genomic dna enzyme digestion을 했는데요..10 마이크로그람을 파이널 20 볼륨에 enzyme 2마이크로리터 넣고 2시간 잘랐습니다. 오버나잇할까하다가 여기분들이 오버나잇하면 스미어 되버린다 그래서 2시간만 했습니다. 그래서 2시간 짜르고 전기영돌 걸어보니 마커만 덩그러니...스미어라도 좀 많이 있으면 뭔가 있나..할텐데 그 스미어도 거의 없습니다... southern 해야하는건데...여기서막히니 진행이 안됩니다. 도와주세요~~!! 뭐가 문젠가요... 라고 질문을했습니다. 다음과 같은 답번들을 해주셨는데요..의견이 다른데요...시간을 늘리라는건지 줄이라는건지 도무지 어느답변이 맞는겁니까..고수분들 제발좀도와주세요~~플리즈~~~~!!! 답변자 : 류민숙 (2007.06.20) 혹시 제한효소처리전 샘플도 전기영동해보았나요? 2시간 후 10ug의 DNA가 없어진 것은 아예 genomic DNA 가 안 뽑힌 것이 아닌가 싶네요. 아니면 DNase가 contamination 되었거나 둘 중 하나 같아요. 한번 지금이라도 DNA 뽑을 것을 전기영동 해보세요. 답변자 : 음.. (2007.06.25) genomic DNA digestion을 하면 원래 smearing되는게 정상 아닌가요? 그리고 genomic DNA를 상대로 2시간 자른다는건 무엇을 의미하는지... 솔직히 genomic DNA digestion을 2시간 자른다는것은 개인적으로 볼때 무의미합니다. genomic DNA는 기본적으로 Megabase 이기때문에 4cutter 6cutter 8cutter로 자른다고 해도 확률적으로 smearing되는것은 당연지사 입니다. 그리고 southern을 위한것이면 더더욱 genomic DNA는 smearing되어 져야 하구요 답변자 : 박재승 (2007.07.16) 저같은 허접실험맨도 답글을 달 수 있는 날이 왔군요. 저도 방선균 gDNA 뽑아서 ,Sau3A1 digestion 하고 있습니다. 저는 DNA 63ug을 50ul 볼륨에 엔자임 0.06Unit/ul을 5ul 넣고 있습니다. 37도씨에서 30분 반응 시키구요. 저의 경우 이렇게 하여 전기영동을 걸어보면 원래 gDNA 사이즈에서부터 밑으로 쭉 끌려서 나옵니다. 님의 경우는 저보다 DNA양도 훨씬 적으시고 엔자임의 경우 님께서 promega 엔자임을 사용하셨을 경우 10unit/ul일 테니까 저보다 70배를 넣으시는 격이네요.... 또한 시간도 길으시고 . . 제의 경우를 봐서라도 다 잘라져서 밑으로 내려갔을지 싶습니다. 사진 첨부합니다. 1번 lane - 3.33Unit/DNA ug 6번 lane - 0.008 Unit/DNA ug 님이 사용하신 것보다 엔자임을 많이 희석해서 사용한 1번 lane의 경우를 보아도 DNA 가 다 잘려 나가 겔 상에서 보이질 않네요
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