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무엇에 쓰시려고 그러시는지요?

마커 사이즈 표시가 없어서 모르겠지만 genomic contamiation 이나 concatemer로

보입니다. open이든 circular든 concatemer든 플라스미드의 성질이 변하는 것이 아니므로

대부분의 경우 그냥 사용해도 무방합니다.

사진을 보다 잠시 옛 추억에 잠깁니다. 실험을 이제 막 시작하시는 것 같군요...가능하면 알라린 라이시스법을 사용하시지 마시고 칼럼을 사용해서 간단하게 분리하세요...시작단계라서 개념 정립에는 필요하지만 어지보면 에너지 낭비입니다...핵산을 뽑는 것이 문제가 아니라 순도 때문에 추후 실험이 어려워집니다...가능하면 대장에게 컬럼을 사달고 해서 셋팅하세요...쉽고 빠르고 간단합니다...사진의 분리한 핵산은 사용하시지 마시고 원하시면 새로 분리하세요....

사진 보니 잘 나온 거 같데요,
제가 보기에도, 플라즈미드 풀린 녀석들 같은데..
키트 사용해도 저런 거 뜹니다.
근데, 왜 슈퍼코일드된 녀석만 필요하신지?
꼭 필요하다면 젤익스트랙션 하면 되지 않을까요?

Plasmid를 뽑는게 너무나 능숙한 사람이라면 plasmid를 뽑고 나서 전기영동하면 supercoiled form만 뽑히게 됩니다. 하지만 그게 아니라면 저 정도의 supercoiled form이외의 plasmid는 뽑히게 마련이예요. 그 band가 무엇인지는 Biochemistry책을 보시면 아실겁니다. 저렇게 뽑혔다고 해서 sequencing이 안되거나 enzyme reaction이 일어나지 않거나...기타 다른 실험을 하는데 방해가 되는 것은 아닙니다. 사실 DNA라는 게 물리적 충격에 잘 깨지기때문에 gel extraction 해도 다시 저런 밴드가 생길 수 있어요. 얼마큼을 loading하셨는지는 모르겠지만 양이 약간 적어보이긴 해도 잘 뽑으신것 같네요. 다만 뽑으신 DNA를 sequencing 하시려면 다시 kit로 깨끗하게 뽑으셔야 제대로된 sequencing 결과를 얻으 실 수 있습니다.

Chromosomal Contamination 같군요.

사실 키트를 사용해도 어차피 Cell 을 Lysis 하는 것은 Alkaline lysis 이고 (약간 buffer의 조성은 틀리지만) 정제만 컬럼으로 하는 것 뿐입니다. 컬럼으로 한다고 해도 실험을 잘못하면 Chromosome 이 오염되는 것은 매한가지입니다. 즉, 3가지 Solution (키트이건 전통적인 방법이건) 을 처리하는 과정에서 얼마나 잘하느냐에 따라서 Chromosome Contamination 은 줄어듭니다.

몇가지 팁

1. Cell을 Harvest 한 후 Resuspend 를 할때의 Cell Mass와 Volume 간의 상관관계가 중요하다 : 일반적인 키트상에서의 Protocol은 아마도 Overnight Culture 한 E.coli 를 E.Tube 하나에 Harvest 했을때를 기준으로 합니다. 그러나 조건에 따라서 Cell Mass는 약간씩 틀려지기 마련이고, Cell 양이 많아지면 충분히 Resuspend 가 되지 않는 경우가 많습니다. Cell 양이 많아진다면 일단 Lysis 에 사용되는 Buffer 양 비율은 균일하게 유지하고 늘려 주는 것이 좋습니다. 그리고 Cfg를 할때 너무 높은 rpm 으로 돌려서 Pellet 이 tight 하게 되면 Suspend 할때 vortex를 심하게 해 주어야 Cell이 풀리게 되고, 이 과정에서도 Cell이 어느정도 Lysis 되는 경우는 꽤 많습니다. resuspend 를 쉽게 하려면 Cell이 Down되기만 하면 좋을 정도의 적당한(?) RPM으로 harvest하는 편이 좋습니다.

2. Lysis step : Cell 양이 너무 많을때는 충분히 Lysis가 일어나지 않는 경우가 많습니다. 그리고 당연한 것이지만 이 과정에서 좀 Gentle하게 해 주십시오.

3. Renaturation step : 이때도 Gentle 하게 해 주는 것이 좋습니다. 과격하게 Handling 하면 Chromosome이 Shearing 할 경우가 있습니다.

4. Purification : 사실 전통적인 Alkaline lysis 나 Qiagen kit 나 이 이전의 스탭은 거기서 거기입니다. 단, kit의 경우에는 실리카 (스핀키트의 경우) 나 anion-exchange (Midi, Maxiprep 의 경우) 를 이용하여 DNA를 정제하고, 전통적인 Alkaline lysis는 phenol 처리, chloroform, EtOH 를 통한다는 정도의 차이가 있을 뿐입니다.

키트를 사용하는 경우에는 가급적 kit에서 recommendation 하는 방법대로 하는 것이 좋지만, 원리를 정확하게 이해한다면 약간 변형해서 자신만의 protocol을 최적화할 수도 있을 것입니다. 저 같은 경우에는 lysis 스탭에서 volume 이 많아질 경우에는 이것을 isopropanol down 을 한 다음, PB buffer 등에 resuspend 하여 스핀컬럼을 돌립니다. 그냥 lysate 를 컬럼에 loading하는 것보다는 한번의 step을 더 거치므로 조금 더 purity는 낫다고 생각합니다만, 물론 구체적인 데이터로 검증해 보지는 않았습니다. -.-;; (따라서 괜히 따라해서 안된다고 저 너무 욕하지 마세요)

사실 DNA 뽑는 것과 같은 것은 매우 일상적인 방법이고, 요즘은 키트를 사용하여 간단히 뽑을 수 있으므로 괜히 이런데 신경 많이 쓰는 것은 좋지 않을 수도 있습니다만, 기본적인 원리를 알아 두고 각각의 Solution 의 역할을 알아두는 것은 매우 중요하다고 생각합니다. 특히 예기치 않은 문제가 생길때 이런 것을 모르면 Troubleshotting하기 매우 힘듭니다. 누가 아나요. 나중에 DNA 뽑는 것만 평생 해서 먹고살지...(실제로 그런 사람들도 있습니다)